Richtlinien zur Einreichung von Proben
Einzelzell-RNA-Sequenzierung Q&A
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Allgemeine Fragen
- Was sind die Eigenschaften von 10X Genomics Einzelzell-markiertem RNA?
- 10X Genomics kennzeichnet Einzelzell-RNA mit A-Schwanz (der 10X-Reverse-Transkriptionsprimer ist olig dT), einschließlich markierter mRNA und lncRNA.
- Kann ich circRNA-Sequenzierung mit der Einzelzell-Sequenzierung von 10X Genomics durchführen?
- 10X Genomics Einzelzellen können circRNA nicht kennzeichnen, daher ist es nicht möglich, circRNA von 10X Einzelzellen zu analysieren.
- Wie erhalte ich Marker-Gene in der Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung?
- 1) cellmarker: einschließlich 13.605 Marker-Gene für 467 Zelltypen aus 158 Gruppen (Untergewebe) im Menschen und 9.148 Marker-Gene für 389 Zelltypen aus 81 Geweben (Untergeweben) in der Maus
2) Literaturübersicht
3) Spekulation über die hochregulierte Genexpression in Subpopulationen
4) homologe Gene von eng verwandten Arten
5) Die eigene Einzelzell-Sequenzierungsdatenbank von CD Genomics
- 1) cellmarker: einschließlich 13.605 Marker-Gene für 467 Zelltypen aus 158 Gruppen (Untergewebe) im Menschen und 9.148 Marker-Gene für 389 Zelltypen aus 81 Geweben (Untergeweben) in der Maus
- An welchen Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierungsprojekten waren Sie beteiligt?
- Wir haben verschiedenen Kunden bei ihren Projekten geholfen, darunter Studien zur Zellheterogenität, Entwicklung und Differenzierung, Immunantwort, Entdeckung neuer Zellen, zelluläre Studien zu gezielten Editierungsgenen, Krankheitsklassifizierung, Konstruktion zellulärer Atlanten usw.
- Was ist der Unterschied zwischen 5'-Ende- und 3'-Ende-Erfassung bei der Konstruktion von Einzelzell-Sequenzierungsbibliotheken?
- Es gibt zwei Hauptmethoden für die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung von 10x Genomics: die Konstruktion von Bibliotheken am 5'-Ende und am 3'-Ende. Bei der Konstruktion von 3'-Ende-Bibliotheken ist die terminale Sequenz der Gelperlen poly(dT), die für die komplementäre Paarung mit der polyA-Struktur am 3'-Ende des Transkriptoms verwendet wird. Bei der Konstruktion von Bibliotheken am 5'-Ende sind die terminalen Sequenzen der Gelperlen Switch-Oligo-Sequenzen mit polyG-Strukturen am Ende. Das Transkript wird durch die Wirkung eines Enzyms die Struktur von polyC an seinem 5'-Ende hinzufügen, wodurch die Paarung abgeschlossen wird.
- Warum wird die 5'-Ende-Erfassungsmethode normalerweise für VDJ verwendet?
- Die Erfassungsmethode zum Aufbau der VDJ-Bibliothek wird durch die 5'-Ende-Erfassungsmethode festgelegt, um den variablen VDJ-Bereich am 5'-Ende anzureichern und gleichzeitig die Sequenzlänge kurz zu halten, anstatt den konservativeren C-Bereich am 3'-Ende, der normalerweise nicht im Fokus der Forschung steht.
- Welche Assoziationsanalysen können für die Einzelzell-Transkriptomsequenzierung und die Einzelzell-ATAC-Sequenzierung durchgeführt werden?
- 1) Assoziation von Subpopulationen, die Transkriptom-Subpopulationen direkt auf ATAC-Zell-Subpopulationen abbildet.
2) Assoziation von genomischen offenen Regionen und nachgelagerter Genexpression.
3) Die Assoziation der zeitlichen Beziehung offener Regionen und der zeitlichen Beziehung der Genexpression.
- 1) Assoziation von Subpopulationen, die Transkriptom-Subpopulationen direkt auf ATAC-Zell-Subpopulationen abbildet.
- Wie wählt man die Tiefe der Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus?
- Die Tiefe der Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung unterscheidet sich nicht wesentlich von der normalen Transkriptom-Sequenzierung. In einer einzelnen Zelle gibt es etwa 10-14.000 Genexpressionsarten, aber die Gesamtzahl aller Gene, die in einem Einzelzell-Sequenzierungs-Batch nachgewiesen werden, übersteigt oft 20.000. Eine Studie, die Daten derselben Zelle mit 180M und 50M Reads verglich, zeigte einen hohen Grad an Übereinstimmung. Darüber hinaus bestimmt die Sequenzierungstiefe die "Auflösung", und es wurde gezeigt, dass die Einzelzell-Sequenzierung eine Gruppe von Zellen mit ähnlichen Expressionsmustern bei etwa 10 effektiv unterscheiden kann.7 liest.
- Wie viele Zellen können gleichzeitig mit der Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung gemessen werden?
- Die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung ist mit einem 8-Kanal-Mikrofluidikchip ausgestattet, der gleichzeitig 8 Proben messen kann. Jeder Kanal kann 100-10000 Zellen messen, ein Chip kann gleichzeitig 100-80000 Zellen erfassen.
- Wie effizient ist die Einzelzellfängung des Einzelzelltranskriptoms? Werden mehrere Zellen erfasst?
- Unter normalen experimentellen Bedingungen liegt die Effizienz der Einzelzellfänge bei bis zu 65%; die Wahrscheinlichkeit, mehrere Zellen zu erfassen, ist äußerst gering, etwa 0,9 % pro 1000 Zellen.
- Was ist die typische Datenmenge, die aus einer einzelnen Zelle gewonnen wird?
- Die offizielle Empfehlung liegt bei 50.000 Reads pro Zelle. Die Anzahl der in einer Zelle exprimierten Gene variiert stark von Gewebe zu Gewebe, und die endgültige Menge der gemessenen Daten muss fallweise analysiert werden.
Für einige Gewebe und Zellen kann dies auf 100 K Reads/Zelle erhöht werden; jedoch kann eine zu hohe Sequierungstiefe auch mehr Rauschen mit sich bringen und die anschließende Datenanalyse erschweren. Bei Verwendung der Illumina PE150 (Doppelend-Sequenzierung) Strategie beträgt die Standardaufnahme etwa 8K Zellen, die Menge an Sequierungsdaten für eine Probe liegt typischerweise bei 120 Gbase/Probe (8000 x 50K x 150 x 2 / 10).9 = 120 Gbase).
- Die offizielle Empfehlung liegt bei 50.000 Reads pro Zelle. Die Anzahl der in einer Zelle exprimierten Gene variiert stark von Gewebe zu Gewebe, und die endgültige Menge der gemessenen Daten muss fallweise analysiert werden.
- Welche Arten von Analysen können aus der scRNA-Sequenzierung verwendet werden?
- Der Standardanalyseprozess umfasst die Qualitätskontrolle der Sequenzierungsdaten und die Statistik verschiedener Indizes (Zellzahl, Anzahl der nachgewiesenen Gene, Datenvolumen, das von einzelnen Zellen gemessen wird, usw.), die Quantifizierung der Genexpression, die Klassifizierung von Zelltypen, das Screening von differentiell exprimierten Genen und die funktionale Annotation usw. Darüber hinaus kann eine personalisierte Analyse unter Berücksichtigung des Projektkontexts und des experimentellen Designs durchgeführt werden.
- Welche Präferenzen gibt es in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung?
- - Verstärkungspräferenzen
- Abbrechungsraten: Einige hoch exprimierte mRNAs können nicht amplifiziert werden.
- Transkriptionelles Platzen
- Hintergrundgeräusche
- Präferenzen aufgrund des Zellzyklus und der Zellgröße
- Chargeneffekt
- - Verstärkungspräferenzen
- Was ist wichtig zu beachten beim Schritt der reversen Transkription in der scRNA-Sequenzierung?
- Die Effizienz der reversen Transkriptase ist entscheidend.
Die Abbruchquoten liegen typischerweise im Bereich von 60 % bis 90 %.
3) Die Abbrecherquoten können zwischen zwei verschiedenen Bibliotheken stark variieren, wenn dieselben Zelllinien mit derselben Methode behandelt werden.
- Die Effizienz der reversen Transkriptase ist entscheidend.
- Was man bei den Amplifikationsschritten im scRNA-Sequenzierungsprozess beachten sollte.
- Jeder Verstärkungsprozess kann zu Präferenzen führen.
Viele Methoden zur Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung verfügen über ein molekulares Barcode-Metrik, um uns bei der Korrektur von Amplifikationspräferenzen zu helfen.
3) Vollständige Transkripte wie SmartSeq2 haben keine molekularen Barcodes und können daher nicht mit der Methode der molekularen Barcodes hinsichtlich der Amplifikationspräferenzen korrigiert werden.
- Jeder Verstärkungsprozess kann zu Präferenzen führen.
- Was sind die Qualitätskontrollpunkte bei der scRNA-Sequenzierung?
- • Einzigartige Paarungsrate
• Verhältnis von Übereinstimmungen zu exonsalen Regionen
• 3'-Präferenz in Einzelzell-Voll-Längen-Transkripten
• Liest gepaart mit mRNA
• Verhältnis von molekularen Barcodes zu Reads
• Anzahl der detektierten Gene
• Nachweis von Spike-in-RNA
• Verhältnis von mitochondrialer zu ribosomaler RNA
- • Einzigartige Paarungsrate
- Was ist das Problem, wenn es nur wenige Spike-in-RNA-Sequenzen gibt?
- Wenn es nur wenige Spike-in-RNA-Sequenzen gibt, kann dies ein direktes Indiz für einen Fehler beim Bibliotheksaufbau sein. Wenn das Spike-in normal ist, aber die Zelle nur wenige RNA-Sequenzen aufweist, kann dies daran liegen, dass die Zelle selbst sehr klein ist oder die Zelle vor dem Aufbau der Bibliothek beschädigt wurde.
- Was ist das Problem, wenn die scRNA-Sequenzierungsergebnisse hohe mitochondriale RNA zeigen?
- Wenn die mitochondriale RNA zu hoch ist, weist dies ebenfalls darauf hin, dass es zu einer Zellzerstörung gekommen ist. Dies liegt daran, dass bei einer Zellzerstörung die zytoplasmatische RNA entweicht, während die mitochondriale RNA nicht austritt, da sie von der mitochondrialen Membran umhüllt ist. Daher wird der Prozentsatz der mitochondrialen RNA hoch sein, wenn es einen Bruch in der Zellmembran gibt.
- Was ist das Problem, wenn ein hoher Prozentsatz an ribosomaler RNA in den Ergebnissen der scRNA-Sequenzierung gefunden wird?
- Wenn der Prozentsatz an ribosomaler RNA hoch ist, kann das daran liegen, dass es in der Zelle eine hohe Menge an RNA-Abbau gibt. Im vollständigen Einzelzelltranskriptom kann die 3'-Präferenz verwendet werden, um das Vorhandensein einer hohen Menge an RNA-Abbau in der Zelle nachzuweisen.
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Probenvorbereitung
- Was sollte ich tun, wenn ich dazu neige, Klumpen bei der Vorbereitung von Einzelzell-Suspensionen zu bilden?
- Fügen Sie einige Tropfen sterile DNAse (1 mg/ml in Wasser gelöst) zur Zellaufhängung hinzu, um die DNA-Stränge zu brechen. Blasen Sie sanft auf die Zellen, um physikalische Schäden an der Zellmembran zu vermeiden.
2) Finde die geeignete Zeit für die enzymatische Verdauung.
3) Waschen Sie die Zellen mit einer kalzium- und magnesiumfreien ausgewogenen Salzlösung, EDTA kann hinzugefügt werden und die Konzentration kann bis zu 2 mM betragen.
Es ist am besten, während der Verdauung nicht heftig zu schütteln, damit die Zellen besonders dazu neigen, in schuppenartiger Weise abzufallen.
- Fügen Sie einige Tropfen sterile DNAse (1 mg/ml in Wasser gelöst) zur Zellaufhängung hinzu, um die DNA-Stränge zu brechen. Blasen Sie sanft auf die Zellen, um physikalische Schäden an der Zellmembran zu vermeiden.
- Wie bereite ich Proben für die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung vor?
- Die Proben, die für die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung verwendet werden, unterscheiden sich zwischen tierischen und pflanzlichen Zellen. Tierische Zellen müssen mit Einzelzell-Suspensionen behandelt werden, während pflanzliche Zellen mit Protoplasten behandelt werden müssen. Frische Proben erfordern in der Regel eine Zellviabilität von 90 % oder mehr, ohne das Vorhandensein von Inhibitoren der reversen Transkription und nicht-zellulären Nukleinsäuremolekülen.
- Warum ist die Zellviabilität nach der Vorbereitung der Einzelzellensuspension so hoch erforderlich?
- Da RNA von toten Zellen in die extrazelluläre Flüssigkeit freigesetzt oder in das GEM lebender Zellen eingemischt wird. Diese freien RNA können von den Zellen umschlossen werden und die nachfolgende Reaktion beeinflussen, was letztendlich zu ungenauen Analyseergebnissen führt. Gleichzeitig wird die hohe Anzahl toter Zellen auch zu einer ungenauen Schätzung der Zellzahl führen und die Erfassungsrate beeinträchtigen.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
