Einzelzell-RNA-Sequenzierungsprotokoll

Vorbereitung der Sammelplatten

Reinigung des Arbeitsplatzes und Vorbereitungen

1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70% (v/v) Ethanol und DNA-Off-Tüchern.
2. Tauchen Sie Aliquots der Reagenzien (Einzelzelllysepuffer) auf Eis oder bei 4 °C auf.
3. Kaltes Metall steht auf Eis oder bei 4°C.
4. Sobald alle Reagenzien aufgetaut sind, mischen Sie sie kräftig.

Einzelzelllyse-Lösung in Platten geben

1. Bereiten Sie die Einzelzelllysepuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. Mischen Sie es, indem Sie das Röhrchen mindestens zehnmal umdrehen, und sammeln Sie es am Boden durch einen kurzen Spin in einer Mikrozentrifuge (5-10 Sekunden bei weniger als 1000 g). Vermeiden Sie es, die Einzelzelllyselösung zu vortexen, da das Detergens aufschäumen und unnötig Zellen binden wird.
2. Montieren Sie die PCR-Rahmenplatten (vier 24-Well-Platten pro Rahmen für eine 96-Well-Rahmenplatte) und stellen Sie sie auf einen schön kalten Metallständer zum Abkühlen.
Übertragen Sie 3 μL des Einzelzelllysepuffers in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.
4. Dichten Sie die PCR-Platten ab. Sammeln Sie die Lyse-Lösung am Boden der Wells durch Zentrifugation für 15 Sekunden bei <2000 g.
5. Halten Sie die Teller auf Eis zur Verwendung im Laufe des Tages.

Dissoziation

Vorbereitungen

Eine Stunde vor Beginn der Dissoziation die Zellkultur mit 5 μM Y-27632 ROCK-Inhibitor ergänzen. Er ist in allen nachfolgenden Schritten enthalten, um Apoptose während der Dissoziation und Verarbeitung zu verhindern.
2. Bereiten Sie ausreichend FACS-Puffer, die Arbeitsverdünnung von TO-PRO-3-Iodid und die Spitzenblockierungslösung vor.
3. Erwärmen Sie TrypLE Express, ergänzt mit 5 μM Y-27632 ROCK-Inhibitor.

Dissociation und Färbung

1. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den in 12-Well-Platten kultivierten Zellen mit einer Mikropipette.
2. Sanft und ohne Agitation mit 2 mL HBSS waschen.
3. Fügen Sie 0,5 mL TrypLE Express ergänzt mit 5 μM Y-27632 ROCK-Inhibitor pro Well hinzu.
4. Inkubieren Sie bei 37 °C auf einem orbitalen Schüttler bei ≤100 U/min. Nach 20 Minuten die Zellen vorsichtig 10-12 Mal auf- und abpipettieren, gefolgt von weiterer Inkubation mit Rühren. Wiederholen Sie das Pipettieren alle 5 Minuten, bis eine Einzelzellaufhängung entsteht.
5. Fügen Sie in der Zwischenzeit TO-PRO-3-Iodid zur FACS-Pufferlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen (außer für die unbehandelten Kontrollen).
6. Zellen sammeln und bei 200g für 4 Minuten zentrifugieren.
7. Für die erste Probe sollten auch die mit Ethanol fixierten Zellen einbezogen und ebenfalls zentrifugiert werden.
8. Resuspendieren Sie in 300 μl FACS-Puffer und filtern Sie durch einen FACS-Filtermesh-Kappen.
9. Halten Sie die Einzelzell-Suspension in FACS-Puffer auf Eis.
10. Führen Sie die FACS-Analyse der Zellen innerhalb von 30 Minuten durch.

Gefärbte Kontrollprobe für tote Zellen

Bereiten Sie frisches 70% Ethanol mit absolutem Ethanol und destilliertem Wasser vor. Übertragen Sie 3 ml in ein FACS-Röhrchen und kühlen Sie es auf Eis.
2. Zellen wie oben beschrieben mit TrypLE Express dissociieren.
3. Resuspendieren Sie in 5 ml Medium und zentrifugieren Sie bei 200 g für 4 Minuten.
4. Zellen in 500 μl HBSS sammeln.
5. Tropfen Sie die Zellaufhängung langsam in das eisige 70% Ethanol, während Sie das FACS-Röhrchen kräftig vortexen, um Zellaggregate zu vermeiden. Lassen Sie keine Tropfen der Zellaufhängung direkt auf das Plastik fallen.
6. Lassen Sie die Proben mindestens 1 Stunde auf Eis, um sie durchlässig zu machen.
Am Tag der Einzelzellensammlung zentrifugieren Sie die fixierten und permeabilisierten Zellen und resuspendieren Sie sie in 300 μL FACS-Puffer mit TO-PRO-3-Iodid.

Fluoreszenz-assistierte Zelltrennung (FACS) lebender Zellen

Vorbereitungen und Einstellungen des Durchflusszytometers

1. Kühlbox mit den vorbereiteten Sammelplatten.
2. Trockeneisbox mit gekühltem Metallständer zum Schnellgefrieren der Einzelzelllysate.
3. Zentrifuge, um die Sammelplatten abzudrehen.
4. Klebeverschlüsse.
5. Kühlbox mit den Proben.

Sortierstrategie

1. Aus allevents: Wählen Sie in FSC-H×SSC-H Zellen der geeigneten Größe und Granularität (gateP1) aus, um Debris auszuschließen.
2. Von gateP1: Wählen Sie Singlets in FSC-A×FSC-W (gateP2).
3. Von gateP2: Wählen Sie in SSC-A×SSC-W erneut Singlets aus (gateP3).
4. Von gateP3: In FSC-H×TO-PRO-3-Iodid, lebende Somata (gateP4) von toten Somata, apoptotischen Körpern und anderem großen Schutt trennen.

Sammlung

1. Von gateP4 (live soma) sortiere ein Ereignis (Zelle) pro Well und gebe 5-nL Volumen in 3 μL Lysepuffer.
2. Nach dem Sammeln einer Platte legen Sie sie in einen eiskalten Metallständer innerhalb der laminarer Strömungseinheit und versiegeln Sie sie sofort mit einer Versiegelungsfolie.
3. Sammeln Sie die Lysate am Boden der Wells durch Zentrifugation für 15 Sekunden bei <2000 g.
4. Stellen Sie die Platte sofort auf einen Metallständer, der auf Trockeneis gekühlt ist, um die Einzelzelllysate schockzufrieren.
Legen Sie die Platten in einen gekühlten Zip-Lock-Beutel auf Trockeneis.
6. Bei -80 °C lagern, bis die Lysate verarbeitet werden.

Einzelzell Smart-Seq2 cDNA-Bibliotheken

Vorbereitungen

1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und Tüchern.
2. Auftauen von Reagenzienaliquots auf Eis.
3. Coole Metallregale auf Eis.
4. Sobald alle Reagenzien aufgetaut sind, kräftig mischen.

Erste Strang-Synthese

1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für die Synthese des ersten Strangs vor. Kippen Sie das Röhrchen um und sammeln Sie es durch einen kurzen Spin in einem Mikrozentrifugen.
Stellen Sie den Thermocycler auf 72 °C ein.
3. Legen Sie die gefrorenen Lysate auf einen eiskalten Metallständer. Verschließen Sie den Plastikdeckel mit einem Spachtel.
4. Zentrifugieren Sie 15 Sekunden bei <2000 g und sammeln Sie die Zelllysate am Boden.
5. Entfernen Sie die PCR-Röhrchenstreifen von der 96-Well-Platte. Die Streifen sind durch den Plastikverschluss zusammengehalten. Dichten Sie sie fest ab und schneiden Sie den überstehenden Rand des Plastikverschlusses ab.
6. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler, setzen Sie den Deckel auf und inkubieren Sie bei 72 °C für 3 Minuten. Dies ist der Denaturierungsschritt der reversen Transkription.
7. Legen Sie die PCR-Röhrchen wieder in die 96-Well-Platte. Kühlen Sie sie sofort für mindestens 2 Minuten auf Eis.
8. Während die Proben abkühlen, starten Sie das Thermocycler-Programm "1_RT_10", um auf 42°C zu erwärmen.
9. Sammeln Sie die Proben durch kurzes Zentrifugieren. Entfernen Sie das Siegel vorsichtig und legen Sie die Piko PCR-Rahmenplatte auf einen eiskalten Metallständer.
10. Verteilen Sie das Reaktionsgemisch für den ersten Strang in einen Acht-Well-Streifen (36,5 μL pro Well). Fügen Sie 2,76 μL des Reaktionsgemisches für den ersten Strang an die Seite jedes Wells mit Einzelzelllysat unter Verwendung einer Mehrkanalpipette hinzu.
11. Versiegeln Sie die PCR-Rahmenplatte.
12. Kombinieren Sie die Synthesereaktion des ersten Strangs mit den Lysaten durch Zentrifugation für 15 Sekunden bei <2000 g.
13. Decken Sie den Teller mit einer Kunststoffabdeckung ab.
14. Entfernen Sie die PCR-Röhrchenstreifen von der 96-Well-Platte. Die Streifen sind durch die Kunststoffdichtung zusammengehalten.
15. Dicht verschließen und den überschüssigen Rand des Plastikverschlusses abschneiden.
16. Legen Sie die Platte in den Thermocycler und setzen Sie den Deckel auf.
17. Führen Sie das Programm "1_RT_10" aus.

Zweite Strang-Synthese und Amplifikation

1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für die Synthese des zweiten Strangs auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. Mischen Sie das Reaktionsgemisch für die Synthese des zweiten Strangs durch Inversion und sammeln Sie es durch Zentrifugation für 15 Sekunden bei <2000 g.
2. Verteilen Sie das Reaktionsgemisch der zweiten Strang in einen Acht-Well-Streifen (100 μL pro Well) als Reservoir zum Pipettieren.
3. Entfernen Sie die Proben der ersten Strang-Synthesereaktion aus dem Thermocycler. Stellen Sie die Piko-PCR-Röhrchenstreifen sofort zurück in den 96-Well-Plattenrahmen und auf einen eiskalten Metallständer.
4. Starten Sie das Thermocycler-Programm "2_ISP_21".
5. Versiegeln Sie mit einem Kunststoffdeckblatt und sammeln Sie die Reaktionen durch kurzes Zentrifugieren für 15 Sekunden bei <2000 g. Stellen Sie die Piko PCR-Rahmenplatte auf einen eiskalten Metallständer und entfernen Sie die Versiegelung vorsichtig.
Fügen Sie 7,5 μL der Reaktionsmischung für den zweiten Strang an die Seite jedes Wells mit den Proben unter Verwendung einer Mehrkanalpipette hinzu.
7. Versiegeln Sie die PCR-Rahmenplatte. Kombinieren Sie die Reaktion durch kurzes Zentrifugieren für 15 Sekunden bei <2000 g.
8. Entfernen Sie die PCR-Röhrchenstreifen von der gerahmten Platte. Die Streifen sind durch das Kunststoffsiegel zusammengehalten. Dichten Sie es fest ab und schneiden Sie den überschüssigen Rand des Kunststoffsiegels ab.
9. Legen Sie die Reaktionsröhrchen für den zweiten Strang in den Thermocycler, setzen Sie den Deckel auf und führen Sie das Programm "2_ISP_21" aus (fahren Sie mit dem zweiten Schritt fort). Dies ist der Schritt der Synthese und Amplifikation des zweiten Strangs.

cDNA-Bibliotheksreinigung

1. Bringen Sie die SPRI-Perlen (19,5% PEG-8k) für mindestens 20 Minuten auf Raumtemperatur.
2. Verteilen Sie die magnetischen Perlen auf einen Acht-Well-Streifen (220 μL pro Well).
3. Fügen Sie spaltenweise 12,5 μL Perlen pro Vertiefung mit einem Mehrkanalpipettierer zu einer 96-Well-Tiefenplatte hinzu.
4. Entfernen Sie die Proben aus dem Thermocycler. Legen Sie die Piko-PCR-Röhrchenstreifen in den Rahmen der 96-Well-Platte und auf einen eisgekühlten Metallständer.
5. Decken Sie die Platte mit einer Kunststoffabdeckung ab und sammeln Sie die Reaktion durch kurzes Zentrifugieren für 15 Sekunden bei <2000 g. Entfernen Sie die Abdeckung vorsichtig und stellen Sie die 96-Well-Platte auf einen eiskalten Metallständer.
6. Spalte für Spalte die Proben mit einer Mehrkanalpipette in die Tiefwellplatten mit den magnetischen Perlen übertragen. Nach jedem Transfer die Perlen und die Reaktion durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren mischen.
7. Decken Sie nach dem letzten Transfer die Proben ab und inkubieren Sie sie 8 Minuten bei Raumtemperatur, damit die magnetischen Perlen an den Proben haften können.
8. Stellen Sie die abgedeckte Platte mit den Proben auf einen Magnetständer, um die Perlen für 5 Minuten zu sammeln.
9. Entfernen Sie die Überstände, ohne die Perlen zu stören. Trocknen Sie die Perlen 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Abdeckung, während die Platte noch auf dem Magnetständer steht.
10. Verteilen Sie die Elutionslösung in einen Acht-Well-Streifen (160 μL pro Well) als Reservoir für die Mehrkanalpipette. Während die Proben noch auf dem Magnetständer sind, fügen Sie pro Well 13 μL Elutionslösung hinzu.
11. Entfernen Sie die Platte vom magnetischen Ständer. Spalte für Spalte die Perlen in der Elutionslösung durch 10-maliges Pipettieren nach oben und unten wieder suspendieren.
12. Decken Sie die tiefen Wellplatten ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Proben von den Perlen zu lösen.
Platzieren Sie die Tiefwellplatte auf dem Magnetständer und binden Sie die Perlen für > 2 Minuten.
14. Beschriften Sie 12 achtwellige Streifen mit niedrigem Nukleinsäurebindungsvermögen und legen Sie sie auf ein eiskaltes Metallgestell.
15. Übertragen Sie spaltenweise 12 μL des Eluats von der Platte auf dem Magnetständer in Acht-Well-Streifen.
Beim Übertragen die Perlen nicht stören. Nach dem Transfer und der Entnahme von Proben zur Quantifizierung die Acht-Well-Streifen versiegeln und bei -20 °C einfrieren.

Quantifizierung und Qualitätskontrolle von Einzelzell-cDNA-Bibliotheken

Quantifizierung von Einzelzell-cDNA-Bibliotheken

Pipettieren Sie 49 μL Assay-Lösung pro Brunnen in schwarze 96-Well-Assay-Platten für Proben. Halten Sie die Assay-Platten im Dunkeln.
2. Sammeln Sie die Einzelzell-cDNA-Bibliotheken durch Zentrifugation der Lagerplatten für 15 Sekunden bei <2000 g. Entfernen Sie vorsichtig das Abdichtblatt.
3. Übertragen Sie spaltenweise 1 μL jeder Einzelzell-cDNA-Bibliothek direkt in die Prüfungsflüssigkeit in einer schwarzen Prüfplatte. Halten Sie die Prüfplatte im Dunkeln.
4. Nach Abschluss des Transfers die Speicherplatte mit den Einzelzell-cDNA-Bibliotheken versiegeln. Diese am Boden der Vertiefung durch Zentrifugation der Speicherplatten für 15 Sekunden bei <2000 g sammeln und bei -20°C lagern.
5. Bereiten Sie die Standards für die Assay-Kalibrierung vor. Geben Sie 47,5 μL Assay-Lösung pro Vertiefung hinzu und fügen Sie 2,5 μL der Standards hinzu. Wir verwenden vier Replikate von jedem Standard 1 (0 ng/μL dsDNA, Hintergrund) und Standard 2 (10 ng/μL dsDNA, obere Grenze).
6. Nach der Vorbereitung beider Proben und der Standards messen wir das Fluoreszenzsignal in einem Spektrofluorometer (Anregung bei 485 nm/Emission bei 530 nm). Die Konzentration der cDNA-Bibliothek aus Einzelzellen wird gemäß der folgenden Gleichung unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors f berechnet._Verdünnung=50 und die Durchschnittswerte der Standards.
7. Nach Abschluss der Messungen die Assay-Platten entsorgen.

cDNA-Qualitätskontrolle

Für jedes Einzelzell-cDNA-Pool bereiten Sie einen Acht-Röhrchen-Streifen vor.
2. Sammeln Sie die Einzelzell-cDNA-Bibliotheken durch Zentrifugation der Lagerplatten für 15 Sekunden bei <2000 g. Entfernen Sie vorsichtig das Versiegelungsblatt.
3. Spalte für Spalte 1 μL jeder Einzelzell-cDNA-Bibliothek in einen Acht-Röhrchen-Streifen kombinieren.
4. Nach Abschluss des Transfers die Speicherplatte mit den Einzelzell-cDNA-Bibliotheken versiegeln. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation der Speicherplatten für 15 Sekunden bei <2000 g am Boden des Wells und lagern Sie sie bei -20 °C.
5. Kombinieren Sie den Inhalt jedes Röhrchens des Acht-Röhrchen-Streifens in ein einzelnes Röhrchen. Dies ist die gepoolte Einzelzell-cDNA-Bibliotheksprobe für das Profiling auf dem Bioanalyzer.
6. Befolgen Sie die Anweisungen des High Sensitivity DNA-Kits (oder eines ähnlichen) und analysieren Sie die cDNA-Profilspuren.

Referenz:

1. Schweingruber C, Nijssen J, Benitez J A, u. a. Single-Cell-mRNA-Seq von in vitro gewonnenen menschlichen Neuronen unter Verwendung von Smart-Seq2[M]//Regulatorische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren. Humana, New York, NY, 2023: 143-164.