RNA 5-Methylcytosin (m5C) Sequenzierung nach Illumina-Protokoll

RNA-Extraktion, -Reinigung und DNase-Behandlung

Die gesamte RNA wird direkt aus dem Gewebe mit 1 mL TRIzol™ gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert und gereinigt. Anschließend wird die RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers mit TURBO™ DNase behandelt. Die Integrität der RNA wird mithilfe eines RNA 6000 Nano Chips auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet.

Generierung des MGFP In Vitro Transkript Spike-in Kontrolle

1. Linearisieren Sie den phMGFP-Vektor mit dem Restriktionsenzym XbaI und reinigen Sie den linearen DNA-Vektor gemäß dem Protokoll des HiScribe T7 In Vitro Transcription Kits.
2. Führen Sie die in vitro Transkription gemäß dem Protokoll des HiScribe T7 In Vitro Transcription Kits durch, indem Sie 1 μg linearisierte DNA verwenden. Eine Inkubationszeit von 4 Stunden bei 37 °C mit den Kit-Komponenten ist ausreichend.
3. Fügen Sie 2 U TURBO™ DNase hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten.
4. Übertragen Sie die Reaktion in ein Phase Lock Gel™-Röhrchen und stellen Sie das Volumen der Reaktion mit ultrapurem H2O auf 100 μL ein.
5. Fügen Sie ein gleiches Volumen Phenol:Wasser und Chloroform hinzu, schütteln Sie kräftig für 15 Sekunden und zentrifugieren Sie bei 15.000 × g für 5 Minuten.
6. Fügen Sie das gleiche Volumen Chloroform wie in Schritt 5 zu dem Rohr hinzu, schütteln Sie kräftig für 15 Sekunden und zentrifugieren Sie erneut bei 15.000 × g für 5 Minuten.
7. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein sauberes 1,5 mL Röhrchen. Fügen Sie 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, 3 Volumina 100% Ethanol und 1 μL Glykogen hinzu; vortexen Sie und fällen Sie die RNA über Nacht bei −80 °C aus.
Zentrifugieren Sie RNA bei 17.000 × g bei 4 °C für 60 Minuten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
Fügen Sie 1 mL 75% Ethanol zur RNA hinzu, kippen Sie fünfmal um und zentrifugieren Sie bei 7500 × g bei 4 °C für 10 Minuten.
10. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie das Pellet etwa 15 Minuten an der Luft trocknen.
11. Resuspendieren Sie die RNA in 25 μL ultrapurem H.₂O.
12. Optionaler Schritt: Behandeln Sie 5 μg des in vitro transkribierten MGFP-Transkripts mit 2 U TURBO™ DNase gemäß dem Protokoll des Herstellers bei 37 °C für 30 Minuten.
13. Bewerten Sie die Integrität und Größe der MGFP in vitro Transkripte mithilfe eines RNA 6000 Nano Chips auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Bisulfit-Konversion von RNA

1. Fügen Sie 1/2000 des MGFP-RNA-Transkripts zu 2μg DNase-behandeltem, gereinigtem Gesamt-RNA hinzu. Erhöhen Sie das Volumen der RNA-Probe auf 20μL mit ultrapurem H2O.
2. Denaturieren Sie RNA, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 75 °C in einem Heizblock erhitzen.
3. Erhitzen Sie die Natriumbisulfatlösung auf 75 °C, fügen Sie 100 μL zur RNA hinzu, vortexen Sie gründlich und zentrifugieren Sie kurz in einer Mikrozentrifuge (13.000 × g für 1 Minute).
4. Bedecken Sie das Reaktionsgemisch mit 100 μL Mineralöl. Decken Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um das Reaktionsgemisch vor Licht zu schützen.
5. Inkubieren Sie bei 75 °C für 4 Stunden in einem Heizblock.
6. Etwa 15 Minuten bevor die Bisulfit-Konversionsreaktion abgeschlossen ist, bereiten Sie zwei Micro Bio-Spin-Säulen für jede Konversionsreaktion vor, indem Sie die Tris-Lösung in der Säule in ein Auffangröhrchen ablaufen lassen. Entsorgen Sie den Tris-Fluss, setzen Sie die Säule zurück in das Auffangröhrchen und zentrifugieren Sie bei 1000 × g für 2 Minuten. Übertragen Sie jede Säule in ein sauberes 1,5 mL-Röhrchen.
7. Entfernen Sie das Bisulfitreaktionsgemisch vom Heizblock und übertragen Sie vorsichtig die wässrige Phase (die sich unter dem Mineralöl befindet), die das Natriumbisulfid/RNA-Gemisch enthält, in die Micro Bio-Spin-Säule.
Zentrifugieren Sie bei 1000 × g für 4 Minuten.
9. Übertragen Sie das Eluat vorsichtig in die zweite Micro Bio-Spin-Säule, die in einem 1,5 mL Röhrchen platziert ist, und wiederholen Sie Schritt 8.
Heizen Sie den Temperaturblock auf 75 °C vor, um sich auf Schritt 12 vorzubereiten.
11. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 1 M Tris–HCl pH 9,0 zur zweiten Elution hinzu, vortexen Sie, zentrifugieren Sie kurz und überlagern Sie dann mit 175 μL Mineralöl. Decken Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um das Reaktionsgemisch vor Licht zu schützen.
12. Inkubieren Sie 1 Stunde bei 75 °C im Heizblock.
Übertragen Sie die untere wässrige Schicht, die die RNA enthält, in ein sauberes 1,5 mL-Röhrchen.
14. Fäll das mit Bisulfit behandelte RNA aus und resuspendiere die bisulfit-konvertierte RNA in H.₂O.

Bisulfit-Oligonukleotid-Primerdesign für cDNA-Synthese und PCR

1. Für eine effiziente parallele Amplifikation von 48 Zielampliconen auf dem Fluidigm Access Array verwenden Sie gezielte cDNA-Synthese, um die Amplifikation von unerwünschten Ampliconen zu reduzieren. Die gezielte cDNA-Synthese wird erreicht, indem Reverse-Transkriptase (RT)-Primer 30–40 nt 3' von den zu untersuchenden Cytosinen entworfen werden.
2. Entwerfen Sie Primer für die erste Runde der PCR-Amplifikation, sodass kleine Amplicons 170–200 bp betragen, um eine effiziente Amplifikation zu ermöglichen. Da der G/C-Gehalt in der Vorlage niedrig ist, entwerfen Sie lange Primer, um sicherzustellen, dass die Tm im Bereich von 59–61 °C liegt. Fügen Sie die CS1-Sequenz (5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3') zur gen-spezifischen Sequenz (GSS) des Vorwärtsprimers und CS2 (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACA-3') zur GSS des Rückwärtsprimers hinzu. Für die zweite PCR-Amplifikation verwenden Sie den Vorwärtsprimer, der die komplementären Sequenzen zur P5 Illumina-Flusszelle kombiniert mit CS1 (P5_CS1) enthält, und den Rückwärtsprimer, der den Barcode und die komplementären Sequenzen zur P7 Illumina-Flusszelle kombiniert mit CS2 (P7_BC_CS2) enthält.

cDNA-Synthese

Mischen Sie 500 ng bisulfid-konvertierte RNA, 1 μL 1 mM dNTP-Mix und 2 μL 10× gepoolten Primer-Mix und fügen Sie ultrapures H hinzu.₂O auf ein Endvolumen von 13 μL. Inkubieren Sie die Mischung bei 65 °C für 5 Minuten, um die RNA zu denaturieren.
2. Transkribieren Sie die bisulfit-konvertierte RNA rückwärts mit SuperScript™ III Reverse Transcriptase gemäß dem Protokoll des Herstellers. Fügen Sie entweder die gepoolten 48 RT-Primer für die parallele Access Array-Amplifikation oder zufällige Hexamere für einzelne PCR-Amplikons hinzu.
3. Nach Abschluss der Reaktion die cDNAs 1:10 in ultrapurem H verdünnen.₂O für die PCR-Amplifikation.

Individuelle PCR-Amplifikation, Quantifizierung und Pooling

1. Für eine 10μL PCR fügen Sie 0,2μL KAPA HiFi DNA-Polymerase, 2μL 5× HiFi Fidelity-Puffer (mit MgCl2), 0,3μL 10 mM dNTP, 0,4μL 10μM Vorwärtsprimer (CS1_GSS), 0,4μL 10μM Rückwärtsprimer (CS2_GSS), 1μL verdünntes cDNA und H2O bis zu einem Endvolumen von 10μL hinzu. Führen Sie die PCR für jedes Amplicon in Dreifachbestimmung durch.
2. Sanft vortexen, kurz zentrifugieren und in einen vorgeheizten Thermocycler geben.
3. Führen Sie ein zweistufiges thermisches Zyklus-PCR-Programm durch.
4. Pullen Sie die Triplikate zusammen und führen Sie eine AMPure-Perlenreinigung im Verhältnis von 1,8:1 durch, um nicht inkorporierte Primer und Primer-Dimere zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
5. Bewerten Sie die Größe und Konzentration des PCR-Amplicons nach der Trennung auf einem Shimadzu Microchip-Elektrophoresesystem MCE®-202 MultiNA.
6. Normalisieren Sie die Konzentration jedes Amplicons im Experiment durch Verdünnung mit H2O auf eine Konzentration im Bereich von 0,5–5 ng/μL.
7. Führen Sie die Barcodierung und die PCR zur Hinzufügung von Illumina-Adaptern durch. Fügen Sie in einer 10μL PCR 0,2μL KAPA HiFi DNA-Polymerase, 2μL 5× HiFi Fidelity-Puffer (mit MgCl2), 0,3μL 10 mM dNTP, 1μL 10μM Vorwärtsprimer (P5_CS1), 1μL 10μM Rückwärtsprimer (P7_CS2), 2μL verdünnten PCR-Amplikon und H2O bis zu einem Endvolumen von 10μL hinzu.
8. Sanft vortexen, kurz zentrifugieren und in einen vorgeheizten Thermocycler legen.
Führen Sie ein zweistufiges thermisches Zyklus-PCR-Programm durch.
10. Bewerten Sie die Größe und Konzentration des PCR-Amplicons nach der Trennung auf einem Shimadzu Microchip-Elektrophoresesystem MCE®-202 MultiNA.
11. Poolen Sie die Amplicons in äquimolarer Konzentration und reinigen Sie sie mit AMPure-Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie ein Verhältnis von Perlen zu gepoolten Amplicons von 0,9:1, um die Bindung der Amplicons und nicht von Primer-Dimeren oder nicht inkorporierten Primern sicherzustellen.
12. Schätzen Sie zunächst die DNA-Konzentration mit einem Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Bewerten Sie dann die DNA-Konzentration genau mit dem KAPA Library Quantification Kit für Illumina®-Plattformen. Führen Sie eine serielle Verdünnung der gebündelten Amplicons durch, sodass sie in den dynamischen Bereich des Assays von 5,5–0,000055 pg/μL fallen.

MiSeq-Sequenzierung

1. Bereiten Sie das Probenblatt mit dem Illumina Experiment Manager gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
2. Verdünnen Sie die Bibliothek auf 10 nM in EBT-Puffer basierend auf den durch die qPCR bestimmten Konzentrationen. Ab diesem Punkt die Bibliotheken auf Eis halten.
Verdünnen Sie die PhiX-Kontrollbibliothek auf 2 nM, indem Sie 8 μL EBT-Puffer zu 2 μL der 10 nM PhiX-Kontrollbibliothek hinzufügen.
4. Denaturieren Sie die zusammengeführten Bibliotheken und die PhiX-Kontrollbibliothek separat, indem Sie 10 μL von 0,2 M NaOH zu 10 μL der 2 nM Bibliotheken hinzufügen.
5. Vortexen Sie gründlich, um zu mischen, und zentrifugieren Sie bei 1000 × g für 30 s. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
6. Verdünnen Sie die denaturierten gepoolten Bibliotheken und die PhiX-Kontrollbibliothek separat auf 20 pM, indem Sie 980 μL vorgekühltes HT1 zu 20 μL denaturierten Bibliotheken hinzufügen.
7. Verdünnen Sie die 20 pM gepoolten Bibliotheken und die PhiX-Kontrollbibliothek separat auf 10 pM, indem Sie 500 μL vorgekühltes HT1 zu 500 μL 20 pM Bibliotheken hinzufügen.
Kombinieren Sie 100 μL der 10 pM PhiX-Kontrollbibliothek mit 900 μL der 10 pM gepoolten Bibliotheken und vortexen Sie, um zu mischen.
Laden Sie 600 μL der endgültigen Probe in die Kartusche. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen entfernt werden, indem Sie die Kartusche vorsichtig klopfen.
10. Führen Sie den Sequenzierungslauf gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.

Referenz:

1. Li J, Wu X, Do T, et al. Quantitative und Einzel-Nukleotid-Auflösung Profilierung von RNA 5-Methylcytosin[M]//RNA-Modifikationen. Humana, New York, NY, 2021: 135-151.