Richtlinien zur Einreichung von Proben
RIP-Sequenzierung Q&A
Allgemeine Fragen
- Welche Informationen sollte ich wissen, bevor ich das RIP-Seq durchführe?
- Bevor Sie eine RIP-SEQ durchführen, müssen Sie in der Regel angeben
• Die Art der durchzuführenden Probe
• Welche RBPs sind von Interesse?
• Ob IP-spezifische Antikörper für diese RBPs verfügbar sind
• Die Art der RNA-Sequenzen, die von den interessierenden RBPs gebunden werden (z. B. mRNA, miRNA, lncRNA, circRNA usw.)
- Bevor Sie eine RIP-SEQ durchführen, müssen Sie in der Regel angeben
- Was sind die Anforderungen für die Auswahl endogener IP für RIP-seq?
- In der Regel müssen für endogenes IP einige notwendige Bedingungen erfüllt sein - (i) es gibt einen Antikörper der IP-Qualität; (ii) die Ausgangsmenge des Proteins sollte groß genug sein.
- Wie wählt man den Antikörper für RIP aus?
- Aufgrund der geringen Bindungsmenge von Protein und RNA ist die IP-Effizienz normalerweise nicht sehr hoch, die Menge an RNA ist gering und das Risiko beim Bibliotheksaufbau ist größer. Daher können Sie mehrere IPs wählen, um die Menge des Produkts zu erhöhen.
- Warum führt WB eine Vorevaluierung vor dem RIP-Experiment durch?
- Die Hauptzwecke des Western Blot sind (i) die Spezifität des Antikörpers zu überprüfen und festzustellen, ob er an das Zielprotein binden kann; (ii) die Identifizierung der Zielproteinbänder durch Massenspektrometrie; und (iii) die Feststellung, ob das Zielprotein in der Probe exprimiert wird und auf welchem Abundanzniveau.
- Mein Antikörper hat ein Zielproteinband für WB, aber warum kein Band für RIP?
- Es gibt viele Immunoassays mit unterschiedlichen Zwecken, wie WB, ELISA, IP, IF, ChIP, IHC(P), FACS, von denen nur WB ein Experiment ist, das die Denaturierung von Proteinen erfordert. In diesem Fall kann jedes Antikörper gegen dieses Protein das Antigen erkennen, das im WB linear wird; jedoch können Antikörper, die für WB geeignet sind, möglicherweise nicht für nicht-denaturierende Tests wie IP, IF und IHC verwendet werden, da die dreidimensionale Struktur natürlicher Proteine viele Bindungsstellen für Antikörper verbirgt und Antikörper auf WB-Niveau nicht an sie binden können.
Um RIP-Experimente durchzuführen, müssen Sie Antikörper auf IP-Ebene kaufen.
- Es gibt viele Immunoassays mit unterschiedlichen Zwecken, wie WB, ELISA, IP, IF, ChIP, IHC(P), FACS, von denen nur WB ein Experiment ist, das die Denaturierung von Proteinen erfordert. In diesem Fall kann jedes Antikörper gegen dieses Protein das Antigen erkennen, das im WB linear wird; jedoch können Antikörper, die für WB geeignet sind, möglicherweise nicht für nicht-denaturierende Tests wie IP, IF und IHC verwendet werden, da die dreidimensionale Struktur natürlicher Proteine viele Bindungsstellen für Antikörper verbirgt und Antikörper auf WB-Niveau nicht an sie binden können.
- Gibt es Qualitätskontrollversuche, die nach der Immunpräzipitation in RIP-Experimenten durchgeführt werden müssen?
- Nach der Immunpräzipitation werden einerseits die angereicherten Proteine einer WB-Qualitätskontrolle unterzogen, um die Spezifität der IP und den Anreicherungseffekt des Zielproteins zu testen. Andererseits sollte RNA extrahiert werden, um eine quantitative Analyse durchzuführen, und die konstruierte Sequenzierungsbibliothek sollte einer Qualitätsprüfung unterzogen werden.
- Worauf muss ich bei RIP-Experimenten achten?
- 1. Verhinderung der unspezifischen Bindung von RNA an Proteine
2. Vermeiden Sie die Störung der RNA-Protein-Bindung.
3. Vermeidung von Kontamination durch exogene RNase
4. Hemmen Sie die Aktivität von endogenem RNase.
5. Wählen Sie geeignete Antikörper für RIP aus.
6. Vermeiden Sie den Abbau von RNA-bindenden Proteinen.
- 1. Verhinderung der unspezifischen Bindung von RNA an Proteine
- Wie bewertet man die WB QC-Ergebnisse nach RIP-Experimenten?
- 1. Wenn das Zielprotein in der Probe exprimiert wird und der Antikörper wirksam ist, kann das Zielprotein in der Probe nachgewiesen werden und Input erzeugt ein Band an der entsprechenden Position.
2. Wenn der verwendete Antikörper das Zielprotein effektiv anreichern kann, wird die IP auch ein Band an der entsprechenden Stelle erzeugen; zusätzlich wird es auch Antikörperbänder geben, die darauf zurückzuführen sind, dass der Antikörper fest an das Protein gebunden ist und vor dem Laden der Probe nicht getrennt werden kann, und die schwere Kette (oder leichte Kette) des enzymmarkierten sekundären Antikörper-gekoppelten Antikörpers, der während der WB-QC hinzugefügt wird, wird ein Band bei 55 kD (oder 25 kD) erzeugen.
3. IgG kann uns helfen zu bestimmen, ob das Immunpräzipitationssystem eine unspezifische Bindung an das Protein aufweist oder nicht, und das RIP-Ergebnis mit hoher Spezifität sollte kein Destinationsband und nur das schwere (oder leichte) Kettenband von IgG zeigen.
- 1. Wenn das Zielprotein in der Probe exprimiert wird und der Antikörper wirksam ist, kann das Zielprotein in der Probe nachgewiesen werden und Input erzeugt ein Band an der entsprechenden Position.
- Wie man miRNA durch RIP-seq entdeckt und deren Funktion vorhersagt?
- miRNAs können zelluläre Prozesse regulieren, die mit der neuronalen Funktion zusammenhängen, einschließlich der Bildung von Neuro-Synapsen. Wir nehmen das Beispiel der Untersuchung von miRNAs in Neuronen. Durch den Bau eines GFP-markierten Vektors und dessen Injektion in die Gehirne von Mäusen erhielten wir miRNA und Ziel-mRNA mittels RIP; und überprüften die RIP-Effizienz durch qRT-PCR. Anschließend wurden die durch RIP gewonnenen RNA-Fragmente hochdurchsatzsequenziert und mit dem Referenzgenom von Mäusen sowie der miRbase-Datenbank verglichen, um Annotationen und GO-Funktionsanreicherungsanalysen usw. durchzuführen, um die Funktionen von miRNAs zu entdecken.
- Ist die IP-angereicherte RNA die RNA, die an das Zielprotein bindet?
- Nicht ganz, RIP reichert das zielgerichtete proteinbindende RNA an, sodass die Abdeckung der Sequierungsreads in den proteinbindenden Regionen des Referenzgenoms höher ist und im Vergleich zu anderen Regionen offensichtliche Spitzen bildet. Aufgrund der Unterschiede in der RNA-Expression und der durch die Amplifikations- und Sequenzierungsprozesse eingeführten Präferenzen kann jedoch die Abdeckung der Reads in nicht angereicherten Regionen ebenfalls hohe und niedrige Spitzen aufweisen, was zweifellos die Identifizierung von Bindungsspitzen (Peak Calling) stört.
Probenvorbereitung
- Wie man die Proben für RIP-seq lagert?
- Nachdem die Proben isoliert und schnell gereinigt sowie etikettiert wurden, sollten sie sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden, und zwar mindestens 30 Minuten lang, und anschließend in einem -80 °C Kühlschrank oder auf Trockeneis gelagert werden, um sicherzustellen, dass die Proben vor der experimentellen Durchführung immer bei -80 °C sind, um eine Proteinabbau zu vermeiden.
- Kann die extrahierte RNA für RIP-Experimente verwendet werden?
- Natürlich nicht, da RIP-Seq durchgeführt wird, indem das RNA-bindende Protein (RBP) mit einem spezifischen Antikörper herabgezogen wird, der an die RNA-Sequenz bindet, und dann die gebundene RNA-Sequenz gemessen wird. Im extrahierten Gesamt-RNA ist kein RBP mehr vorhanden.
- Wie viel tierisches Gewebe wird für RIP-seq entnommen? Und wie erfolgt die Probenentnahme?
- Tiergewebe
1. Entfernen Sie frisches Gewebe, das Gewebetypen ausschließen sollte, die für die Studie nicht erforderlich sind, wie Binde- und Fettgewebe.
2. Spülen Sie die Gewebeoberfläche schnell mit vorgekühlter 0,9%iger Kochsalzlösung ab, um verbleibendes Blut zu entfernen.
3. Wenn das Gewebe groß ist, versuchen Sie, das Gewebe in kleine Stücke von ≤ 0,5 cm in Länge, Breite und Höhe (d.h. in der Größe einer Sojabohne) zu schneiden.
4. Mischen Sie die verarbeiteten Gewebeproben gut und lagern Sie sie in einem Lyophilisationstube mit Schraubverschluss von 10 ml oder größer, genau beschriftet.
5. Schnell in flüssigem Stickstoff für 30 Minuten lagern und dann zur Aufbewahrung bei -80°C oder in flüssigem Stickstoff transferieren.
6. Transport: Legen Sie die lyophilisierten Röhrchen in 50 ml Zentrifugenröhrchen oder in gut verschlossene Plastiktüten und transportieren Sie sie auf Trockeneis.
Die Stichprobengröße für Tiergewebe
1. Einzelne kleinere Tiere wie Mäuse, Küken, Zebrafische usw. Leber, Herz, Gehirn und andere Gewebe: >1g.
2. Einzelne größere Tiere wie Schweine, Rinder, Schafe usw. Muskel, späte Embryonen und andere Gewebe: >2g Fettgewebe >10g.
3. Ganze Individuen wie Insekten: >3g.
- Tiergewebe
- Wenn Tumorproben untersucht werden, welche Probenanforderungen gelten für RIP-Seq?
- 1. Für Tumorgewebe sollten Tumor- und normales Gewebe so genau wie möglich bestimmt werden, und wenn möglich, bitte den Entnahmeort basierend auf den Ergebnissen des Gefriersectionsberichts beurteilen. Tumorgewebe sollte aus dem umgebenden normalen Gewebe excidiert werden (normales Gewebe sollte ebenfalls aus dem umgebenden Tumorgewebe excidiert werden).
2. Teilen Sie das Gewebe sofort nach der Isolation in Stücke von etwa 2-3 mm Dicke und legen Sie das Gewebe in ein Lyophilisationsröhrchen mit Schraubverschluss von 2,0 ml oder größerem Volumen.
3. Schnell in flüssigem Stickstoff für 30 Minuten einfrieren, dann zur Lagerung bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff transferieren.
4. Transport: Legen Sie die lyophilisierten Röhrchen in 50 ml Zentrifugenröhrchen oder kleine Plastiktüten mit guter Dichtheit und transportieren Sie sie auf Trockeneis.
5. Tumorgewebe: >1 g.
- 1. Für Tumorgewebe sollten Tumor- und normales Gewebe so genau wie möglich bestimmt werden, und wenn möglich, bitte den Entnahmeort basierend auf den Ergebnissen des Gefriersectionsberichts beurteilen. Tumorgewebe sollte aus dem umgebenden normalen Gewebe excidiert werden (normales Gewebe sollte ebenfalls aus dem umgebenden Tumorgewebe excidiert werden).
- Kann Pflanzengewebe für RIP-SEQ verwendet werden? Wie viele Pflanzenproben muss ich bereitstellen?
- Die IP-Anreicherungserträge sind gering, und der Aufbau der Bibliothek kann scheitern, wenn die erforderliche Ausgangsmenge nicht erreicht wird. Besonders bei Pflanzengeweben muss die Menge der gesendeten Proben garantiert werden, da Pflanzenblätter, Früchte, Knollen oder Rhizome hohe Konzentrationen an polysaccharid-polyphenolischen Substanzen sowie anderen komplexen unbekannten Komponenten enthalten, die schwer zu extrahieren sind.
1. Aus dem Pflanzenkörper werden frische Gewebe entnommen. Für im Feld oder auf dem Feld gewonnenes Material muss der Staub oder die Erde auf der Oberfläche des Materials nach der Entnahme abgespült und trocken getupft werden.
2. Wenn das Gewebe groß ist, sollte es so weit wie möglich in kleine Stücke geschnitten und dann in ein Lyophilisationsröhrchen mit 10 ml oder größerem Volumen gelegt oder fest in Alufolie gewickelt und in einen selbstverschließenden Beutel gelegt werden, der genau beschriftet ist.
3. Schnell in flüssigem Stickstoff für 30 Minuten platzieren und dann zur Lagerung bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff überführen.
4. Probenvolumen. Wurzelmasse: >5g. Wurzelsystem: >5g. Stängel: >5g. Blätter: >5g. Früchte: >10g. Samen: >5g. Blütenstand, Staubblätter, Pollen: >2g.
- Die IP-Anreicherungserträge sind gering, und der Aufbau der Bibliothek kann scheitern, wenn die erforderliche Ausgangsmenge nicht erreicht wird. Besonders bei Pflanzengeweben muss die Menge der gesendeten Proben garantiert werden, da Pflanzenblätter, Früchte, Knollen oder Rhizome hohe Konzentrationen an polysaccharid-polyphenolischen Substanzen sowie anderen komplexen unbekannten Komponenten enthalten, die schwer zu extrahieren sind.
- Meine Probe ist eine Zelle. Was muss ich tun, bevor ich die RIP-Seq-Lieferung durchführe?
- Zellen in der Wandkultur sollten in eine Zellaufschlämmung verarbeitet und zweimal mit PBS-Puffer (vorbereitet ohne Rnase) gewaschen werden, bei 3.000 U/min, 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert, das Überstand abgegossen und genau beschriftet.
Schnell in flüssigem Stickstoff für 30 Minuten einfrieren, dann bei -80 °C lagern oder in flüssigem Stickstoff aufbewahren.
3. Transport: Legen Sie die lyophilisierten Röhrchen in 50 ml Zentrifugenröhrchen oder kleine Plastiktüten mit guter Dichtheit und transportieren Sie sie auf Trockeneis.
4. Stichprobengröße: 1 x 108.
- Zellen in der Wandkultur sollten in eine Zellaufschlämmung verarbeitet und zweimal mit PBS-Puffer (vorbereitet ohne Rnase) gewaschen werden, bei 3.000 U/min, 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert, das Überstand abgegossen und genau beschriftet.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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