RIP-Seq – Kartierung der Bindungsstelle von Protein-RNA-Komplexen und Interpretation epigenetischer Regulation

Moleküle innerhalb der Zelle kommunizieren miteinander, um die normalen Zellfunktionen auszuführen. Biomoleküle können Komplexe miteinander bilden, um eine spezifische Rolle zu erfüllen. RNA und Proteine sind dafür bekannt, miteinander zu interagieren und Komplexe zu bilden, die als Ribonukleoproteine oder RBPs bezeichnet werden und wichtig sind für posttranskriptionale Modifikationen und Regulationen wie RNA-Spaltung, Transport, Lokalisierung, Sequenzbearbeitung und andere translationalen Kontrollen. Die Analyse der Bindungsstellen dieser Ribonukleoproteine ist nützlich, um die transkriptionale und epigenetische Regulation, die in der Zelle stattfindet, zu verstehen. Die Informationen, die aus diesen Studien gewonnen werden, können verwendet werden, um Krankheitsziele zu bestimmen und die Entwicklung neuartiger und effektiver Arzneimittelziele zu fördern.

Immunopräzipitation wird verwendet, um Proteinantigene durch Präzipitation unter Nutzung der Spezifität der Bindung zwischen bestimmten Proteinantigenen und ihren entsprechenden Antikörpern zu isolieren. Die Ergebnisse können dann in einem Mikroarray analysiert werden. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Proteine zu präzipitieren, die mit RNA in Kontakt stehen (RIP-Chip). Eine weitere verwandte Technik ist die RNA-Immunopräzipitation-Sequenzierung oder RIP-SeqStatt das Protein zu analysieren, das an RNA bindet, ist RNA das Ziel von RIP-Seq. Die RNA-Komponente wird mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken sequenziert. RIP-Seq kartiert die Bindungsstelle des Protein-RNA-Komplexes und liefert die Einzelbasen-Sequenz der protein-gebundenen RNA.

RIP-Seq wird häufig verwendet, um epigenetische und transkriptomische Kontrollen von Ribonukleoproteinen zu untersuchen. Es ist bekannt dafür, die Wechselwirkungen der beiden Biomoleküle auf genomweiter Ebene aufzudecken. Es wurde nach der RIP-Chip-Technologie entwickelt, die 1999 von Keene et al. eingeführt wurde. Sein relativ kurzes und einfaches Protokoll erfordert keine Verwendung komplexer Laborausrüstung. Der Erfolg der RIP-Seq-Analyse hängt von der ordnungsgemäßen Optimierung des Immunpräzipitationsschrittes ab, da dieser die Strenge der Behandlung bestimmt, um sicherzustellen, dass die RNA-Komponente nicht beschädigt wird und die Bindungsstellen zwischen RNA und Protein nicht zerstört werden.

Abbildung 1. Arbeitsablauf des RNA-Immunpräzipitations-Sequenzierungsprotokolls. (Gagliardi, 2016)

Während der RNA-Immunpräzipitation-Sequenzierung wird der Ziel-RNA-Protein-Komplex mit einem entsprechenden Antikörper ausgefällt. Anschließend erfolgt eine RNase-Digestion, um zusätzliche RNA-Sequenzen zu entfernen, die nicht mit dem Protein in Kontakt stehen. Die resultierende RNA wird dann extrahiert und in cDNA umgeschrieben, die anschließend sequenziert und wieder auf das Genom abgebildet wird. Dieser Prozess kann verwendet werden, um spezifische RNA-Protein-Komplexe mit hoher Auflösung auf der RNA-Sequenz zu untersuchen, die direkt an das Protein gebunden ist.

RIP-seq wurde in verschiedenen Studien verwendet, um die Kaskade von Aktivitäten innerhalb der Zelle zu verstehen. Werfel, u. a.. verwendeten diese Technik, um die Aktivitäten von Mikro-RNAs (miRNAs) zu untersuchen. Sie konnten nachweisen, dass die Aktivität von Säugetier-miRNAs durch eine bevorzugte Bindung an eine bestimmte 3'-Region beeinflusst wird, was den Weg für die Regulation zwischen potenziellen Zielen ebnete. Bersani, u. a.. verwendeten die Technologie, um das Verhalten von Wig-1, einem RNA-bindenden Protein, das multiple mRNAs bindet und deren Expression reguliert, zu untersuchen. Ihre Studie legt neuartige Bindungsstellen für Wig-1 nahe und einen potenziellen Zusammenhang zwischen ihren Ergebnissen und der Stressreaktion sowie der Tumorsuppression.

Die RIP-seq-Technologie hat sich in verschiedenen Studien zur epigenetischen und transkriptionellen Kontrolle als nützlich erwiesen. Sie bietet Einblicke in die spezifischen Bindungsmechanismen von RNA-bindenden Proteinen, die zur Vorhersage von Ziel-mRNAs verwendet werden können. Sie kann auch zur Untersuchung der Krankheitsentwicklung, einschließlich Krebs, und zur Entwicklung neuer Therapeutika eingesetzt werden.

Referenzen:

1. Bersani, C., u. a.Genomweite Identifizierung von Wig-1 mRNA-Zielen durch RIP-Seq-Analyse. Oncotarget, 2015, 7(2).
2. Nicholson, C.O., Friedersdorf, M., Keene, J.D. Quantifizierung von RNA-Bindungsstellen im gesamten Transkriptom mittels DO-RIP-seq. RNA-Zeitschrift, 2016, 23(1).
3. Wessels, H., Hirsekorn, A., Ohler, U. et alN. Identifizierung von RBP-Zielen mit RIP-seq. Methoden in der Molekularbiologie, 2016.
4. Gagliardi M., Matarazzo M.R. RIP: RNA-Immunopräzipitation. In: Lanzuolo C., Bodega B. (Hrsg.) Polycomb-Gruppe-Proteine. Methoden in der Molekularbiologie, 2016.