Ribosomale RNA-Depletion für massiv parallele RNA-Sequenzierungsprotokolle

Vorbereitung von Gesamt-RNA

Führen Sie eine Dnase-Behandlung der Gesamt-RNA durch, um DNA-Kontamination zu entfernen. Die Gesamt-RNA wird mit einem RNA-Kit oder TRIzol®-Reagenz isoliert. Resuspendieren Sie die isolierte Gesamt-RNA in DEPC-behandeltem Wasser entsprechend. Überprüfen Sie die Qualität der Gesamt-RNA.

Hybridisierungsschritt

1. Stellen Sie ein Wasserbad oder einen Heizblock auf 70-75 °C ein.
2. Fügen Sie in ein steriles, RNase-freies 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen Gesamt-RNA (0,5-10 mg) in weniger als 10 mL, 8 mL bakterielle 16S- und 23S-Sondenmengen (12,5 pmol/mL) und 100 mL Hybridisierungs-Puffer hinzu.
3. Inkubieren Sie das Röhrchen 5 Minuten bei 70-75 °C, um die RNA zu denaturieren.
4. Lassen Sie die Probe über einen Zeitraum von 30 Minuten langsam auf 37 °C abkühlen, indem Sie das Röhrchen in ein 37 °C Wasserbad stellen. Kühlen Sie die Proben nicht schnell, indem Sie die Röhrchen in kaltes Wasser stellen.

Vorbereitung der Perlen

1. Resuspendieren Sie die magnetischen Perlen in ihrer Originalflasche durch gründliches Vortexen.
2. Pipettieren Sie 750 mL der Perlenaufhängung in ein steriles, RNase-freies 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Stellen Sie das Röhrchen mit der Perlenaufhängung für 1 Minute auf einen Magnetseparator. Die Perlen setzen sich an die Röhrchenwand, die dem Magneten zugewandt ist. Aspirieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie den Überstand.
4. Fügen Sie 750 mL DEPC-Wasser zu den Perlen hinzu und resuspendieren Sie die Perlen durch langsames Vortexen.
5. Stellen Sie das Röhrchen für 1 Minute auf einen Magnetseparator. Aspirieren Sie und entsorgen Sie den Überstand.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 einmal.
7. Resuspendieren Sie die Perlen in 750 mL Hybridisierungs-Puffer und übertragen Sie 250 mL Perlen in ein neues Röhrchen und halten Sie das Röhrchen bei 37 °C für die spätere Verwendung.
8. Stellen Sie das Röhrchen mit 500 mL Perlen für 1 Minute auf einen Magnetseparator. Aspirieren Sie und entsorgen Sie den Überstand.
9. Resuspendieren Sie die Perlen in 200 mL Hybridisierungs-Puffer und halten Sie die Perlen bei 37 °C bis zur Verwendung.

Entfernung von rRNA

1. Nach der Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten der hybridisierten Probe (oben) zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
2. Übertragen Sie die Probe (ca. 118 mL) zu den vorbereiteten magnetischen Perlen. Pipettieren Sie auf und ab oder vortexen Sie bei niedriger Geschwindigkeit, um gut zu mischen.
3. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten bei 37 °C. Mischen Sie während der Inkubation gelegentlich vorsichtig den Inhalt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um die Probe zu sammeln.
4. Stellen Sie das Röhrchen für 1 Minute auf einen Magnetseparator, um den rRNA-Komplex zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand nicht. Der Überstand enthält RNA.
5. Stellen Sie das Röhrchen mit 250 mL Perlen aus Schritt 7 für 1 Minute auf einen Magnetseparator. Aspirieren Sie und entsorgen Sie den Überstand.
6. Fügen Sie zu diesem Röhrchen mit Perlen ca. 318 mL Überstand mit RNA hinzu. Pipettieren Sie auf und ab oder vortexen Sie bei niedriger Geschwindigkeit, um gut zu mischen.
7. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten bei 37 °C. Mischen Sie während der Inkubation gelegentlich vorsichtig den Inhalt. Sammeln Sie die Probe am Boden des Röhrchens durch kurzes Zentrifugieren.
8. Stellen Sie das Röhrchen für 1 Minute auf einen Magnetseparator, um den rRNA-Sondenkomplex zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand nicht, da der Überstand RNA enthält.
9. Übertragen Sie den Überstand mit RNA in ein neues Röhrchen.

Konzentrieren

Konzentrieren von RNA durch Ethanol-Präzipitation

1. Übertragen Sie die RNA-Probe in ein sauberes, RNase-freies 1,5 mL oder 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 1 mL Glykogen (20 mg/mL), 1/10 des Volumens der Probe (eluiert RNA) von 3 M Natriumacetat, 2,5× Volumen der Probe von 100% Ethanol zu den folgenden Komponenten der RNA hinzu.
3. Gut mischen und mindestens 30 Minuten bei −80 °C inkubieren.
4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 15 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
5. Fügen Sie 500 mL 70% kaltes Ethanol hinzu.
6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
7. Wiederholen Sie die Schritte 5 und 6 einmal.
8. Lassen Sie das Pellet etwa 5 Minuten an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das RNA-Pellet in 10-30 mL DEPC-behandeltem Wasser.
9. Lagern Sie die RNA auf Eis oder bei -80 °C bis zur Verwendung.

Referenz:

1. Chen Z, Duan X. Ribosomale RNA-Depletion für massiv parallele bakterielle RNA-Sequenzierungsanwendungen[M]//Hochdurchsatz-Nächste-Generation-Sequenzierung. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 93-103.