Häufig gestellte Fragen zur mikrobiellen Sequenzierung

Allgemeine Fragen

Was ist die Sequenzierung der mikrobiellen Gemeinschaftsvielfalt?

Die Identifizierung mikrobieller Populationen umfasst Hochdurchsatz-Sequenzierung von bakteriellen 16S-rRNA-Genen und pilzlichen 18S-rRNA-Genen sowie ITS (Internal Transcribed Spacer)-Sequenzen. Das Ziel ist es, mikrobielle Populationen durch die Sequenzierung spezifischer genetischer Regionen zu charakterisieren. Der Begriff "16S-rRNA-Gen" (18S-rRNA-Gen) bezieht sich auf die entsprechenden DNA-Sequenzen, die die ribosomale 16S-rRNA (18S-rRNA) in bakteriellen (pilzlichen) Genomen kodieren. Diese Gene enthalten neun hypervariable Regionen (V1-V9) und zehn konservierte Regionen. Das ITS, bestehend aus ITS1 und ITS2, befindet sich zwischen den 18S- und 5,8S-Regionen sowie den 5,8S- und 28S-Regionen in der eukaryotischen ribosomalen rRNA-Gen-Sequenz. Die Sequenzierung dieser spezifischen Regionen liefert wertvolle Informationen über mikrobielle Arten und deren Häufigkeit.

In den vorliegenden analytischen Ergebnissen wirft das Fehlen einer bestimmten Art die Frage auf, ob man schließen kann, dass die Art im Muster tatsächlich abwesend ist?

In der Theorie impliziert das Fehlen von Informationen über eine bestimmte Art in der analysierten Probe deren Nichtexistenz in dieser Probe. Allerdings könnten zwei praktische Szenarien diese Bestimmung beeinflussen. Erstens könnten die verwendeten PCR-Primer eine Verzerrung aufweisen, was bedeutet, dass die Art in der Probe vorhanden sein könnte (wenn auch in geringer Häufigkeit), aber die PCR-Amplifikation fehlschlägt, was zu ihrer Nichterkennung in der anschließenden Sequenzierung führt. Zweitens könnte das Fehlen relevanter Informationen über diese Art in der Datenbank dazu führen, dass die erhaltenen Sequenzen während der Analyse nicht mit Informationen über die Art abgeglichen werden können, selbst wenn die Art in den sequenzierten Daten vorhanden ist.

Im Hinblick auf das experimentelle Design des Projekts zur mikrobiellen Vielfalt ist es entscheidend, biologische Replikate einzubeziehen, um die Variabilität innerhalb der biologischen Proben zu erfassen und die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

Die Einbeziehung biologischer Replikate ist ein entscheidender Aspekt bei der Planung von Diversitätsprojekten, insbesondere solchen, die sich auf differentiellen Analysen konzentrieren. In Studien, die differentiellen Analysen beinhalten, werden sowohl parametrische als auch nicht-parametrische Tests, wie t-Tests und Rangsummentests, häufig eingesetzt. Unabhängig von der Testmethode sind Berechnungen, die Parameter wie Varianz und Mittelwert betreffen, integraler Bestandteil, und sinnvolle numerische Werte können nur abgeleitet werden, wenn biologische Replikate vorhanden sind. Aus der Perspektive der Datenanalyseprinzipien sind biologische Replikate daher unverzichtbar. Darüber hinaus sind die Faktoren, die Umweltproben in der Diversitätsforschung beeinflussen, von Natur aus komplex. Eine einzelne Probe, die eine Gruppe repräsentiert, ist unzureichend und führt zu unzuverlässigen Ergebnissen. Die Einbeziehung biologischer Replikate verleiht der Studie statistische Signifikanz und erhöht ihre Zuverlässigkeit angesichts der vielschichtigen Einflüsse auf Umweltproben in der Diversitätsforschung.

Was sind die Unterschiede zwischen biologischen Replikaten, technischen Replikaten und gepoolten Proben?

Über die Diversitätsforschung hinaus sind in herkömmlichen experimentellen Designs die Unterscheidungen zwischen biologischen Replikaten, technischen Replikaten und gepoolten Proben stets entscheidende Überlegungen, die das experimentelle Design beeinflussen. Lassen Sie uns die Definitionen und die Bedeutung dieser drei Konzepte näher betrachten.
Biologische Replikate beziehen sich in einfachen Worten auf verschiedene Proben, die derselben Behandlung unterzogen werden. Die Einbeziehung biologischer Replikate zielt darauf ab, allgemeine Schlussfolgerungen zu validieren, indem die Ergebnisse einer Probenreihe zusammengefasst und diese Eigenschaften auf die gesamte Kategorie von Proben verallgemeinert werden.
Technische Replikate sind Wiederholungen technischer Verfahren, die während Experimenten eingeführt werden, um potenzielle Fehler oder Abweichungen zu berücksichtigen. Zum Beispiel bildet das Durchführen von drei Sequenzierungen mit derselben Bodenprobe eine Gruppe technischer Replikate, die die Stabilität der Bibliotheksvorbereitung und der Sequenzierungsergebnisse innerhalb eines angemessenen Rahmens zeigt.
Pooled-Proben, wie der Name schon sagt, beinhalten das gründliche Mischen mehrerer Proben (häufig in gleichen Anteilen). Das Poolen von Proben dient dazu, Unterschiede zwischen den einzelnen Proben zu homogenisieren und bietet eine repräsentativere Mischung, die die Merkmale dieser Probenkategorie besser erfasst.
Diese drei Beispiel-Designansätze können je nach Forschungszielen kombiniert oder einzeln eingesetzt werden. Bei spezifischen Anfragen können Sie sich gerne an unser technisches Team wenden.

Allgemeine Richtlinien für die experimentelle Probenentnahme.

Bodenprobenentnahme: Wählen Sie einen repräsentativen Bodenbereich aus und verwenden Sie sterile Werkzeuge, um eine bestimmte Menge Boden in einer Tiefe von 5-10 cm zu entnehmen. Entfernen Sie alle Verunreinigungen, portionieren, kennzeichnen und versiegeln Sie jede Probenbeutel, die etwa 5-10 g Boden enthält. Lagern Sie die versiegelten Proben sofort bei niedrigen Temperaturen.
Stuhlprobenentnahme: Verwenden Sie sterile Stuhlprobenentnahmegeräte oder andere sterilisierten Behälter zur Sammlung von Stuhlproben. Portionieren, kennzeichnen und lagern Sie die Proben umgehend bei niedrigen Temperaturen (alternativ zuerst kennzeichnen und lagern, bevor Sie portionieren). Verteilen Sie jede Probe auf mehrere sterile Zentrifugenröhrchen, die jeweils etwa 0,2 g enthalten. In Fällen, in denen der individuelle Mäusestuhl unzureichend ist (<0,2 g), können biologische Replikate kombiniert werden. Vermeiden Sie eine längere Exposition der Stuhlproben gegenüber Luft, um Kontamination und Abbau zu verhindern. Für wertvolle oder schwer zu sammelnde Proben ist es ratsam, Sicherungskopien zu erstellen.

Meine Ergebnisse zur Nukleinsäureextraktion und Qualitätskontrolle von Umweltproben sind nicht zufriedenstellend. Kann ich trotzdem mit der Amplicon-Sequenzierung fortfahren?

Die Amplicon-Sequenzierung umfasst die PCR-Amplifikation spezifischer genomischer Regionen für eine bestimmte Gruppe von Mikroorganismen. Die DNA-Qualitätsprüfung ist nur ein Teil der Qualitätsbewertung, und die Entscheidung, mit der Sequenzierung fortzufahren, hängt vom Qualitätskontrollbericht der PCR-Amplifikation ab. In Fällen, in denen die Nukleinsäureextraktion nur begrenztes Material liefert, aber eine ausreichende Qualität und Menge an PCR-Produkten erzielt werden kann, kann die Sequenzierung dennoch durchgeführt werden.

Meine Studie konzentriert sich auf endophytische Bakterien, und ich beabsichtige, Amplicon-/Metagenom-Projekte durchzuführen. Welche Risiken gibt es und welche Empfehlungen haben Sie für die frühen Phasen des Experiments?

Zunächst sollte geprüft werden, ob endophytische Bakterien isoliert werden können. Wenn eine Isolation nicht möglich ist, besteht ein inherentes Risiko der Kontamination von Pflanzen- und Tiergeweben in der Probe. Das potenzielle Risiko bei der Amplicon-Sequenzierung liegt in der Amplifikation von Pflanzenchloroplasten und tierischen mitochondrialen Sequenzen. Die metagenomische Sequenzierung kann zu erheblichen Wirtskontaminationen führen, insbesondere wenn der Wirt kein Referenzgenom hat. In solchen Fällen sollte die Amplicon-Sequenzierung als bevorzugte Option in Betracht gezogen werden.

Vorexperimentelle Empfehlungen:

Für die Amplicon-Sequenzierung ist es ratsam, eine Literaturübersicht durchzuführen, um Primer auszuwählen, die Chloroplasten-Sequenzen effektiv ausschließen, und so die Machbarkeit der Studie zu bewerten.
Für die metagenomische Sequenzierung wird ein Vorabtest an einer Teilmenge von Proben empfohlen. Dies ermöglicht ein Verständnis des Anteils von Wirts- (Pflanzen und Tieren) und mikrobiellen Komponenten innerhalb der Proben. Es ist entscheidend zu bewerten, ob die mikrobiellen Daten für nachfolgende Analysen ausreichend sind. Wenn die mikrobiellen Daten unzureichend sind, kann zusätzliche Sequenzierung in Betracht gezogen werden, um ein analysierbares Datenset zu erreichen.