Was ist DAP-Seq?

DNA-Affinitätsreinigung-Sequenzierung (DAP-seq) ist eine epigenomische Sequenzierungstechnologie, die in den letzten Jahren im Bereich der Pflanzenforschung entstanden ist. Sie ist in der Lage, sich auf ein Protein (z. B. verschiedene Transkriptionsfaktorproteine, die an der Genexpression beteiligt sind) zu konzentrieren, die DNA-Sequenzen zu untersuchen, an die solche Proteine gebunden sind, die Bindungseigenschaften zu analysieren und das Bindungsmuster der Proteine zu identifizieren, um die Gene zu bestimmen, die von den Proteinen reguliert werden. Der größte Vorteil der DAP-seq-Technologie besteht darin, dass sie die in vitro-Expression von markierten Proteinen nutzt, um das Expressionsprodukt an die Zielgenomsequenz zu binden, wodurch das Dilemma des Mangels an Proteinantikörpern, mit dem die Pflanzenforschung in der Vergangenheit lange Zeit konfrontiert war, perfekt umgangen wird.

Vorteile der DAP-seq-Technologie

DNA-Affinitätsreinigung Sequenzierung (DAP-seq) stellt einen zeitgenössischen Durchbruch in der Erforschung transkriptioneller Regulierungsstellen dar, der in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat. Dieser innovative Ansatz beinhaltet die Verwendung von In-vitro-Konstrukten zur Expression von Transkriptionsfaktor (TF)-Proteinen. Diese Proteine binden selektiv an Zielgenomfragmente, wodurch die Sequenzierung von protein-gebundenen Genfragmenten ermöglicht wird, um anschließend Bibliotheken zu erstellen und die Bindungssequenzen der TFs zu analysieren.

Die Ankunft von DAP-seq-Technologie adressiert historische Einschränkungen, die mit der Knappheit von TF-Antikörpern und suboptimaler Bindungseffizienz verbunden sind. Durch die Überwindung dieser Einschränkungen erweitert DAP-seq erheblich die Möglichkeiten der TF-Faktorenforschung. Diese transformative Technologie löst nicht nur vergangene Herausforderungen, sondern ermöglicht auch eine umfassendere und nuanciertere Erforschung der Dynamik von Transkriptionsfaktoren, was einen erheblichen Fortschritt in diesem Bereich darstellt.

Übersicht über den DAP-seq-Experimentellen Prozess

• Vorbereitende Maßnahmen

(1) Machbarkeitsbewertung: Beginnen Sie den Prozess, indem Sie die CDS-Sequenz des Transkriptionsfaktors zur Bewertung bereitstellen.

(2) Probenvorbereitung: Stellen Sie eine ausreichende Menge an Proben sicher, indem Sie die in den Richtlinien zur Probenlieferung dargelegten Vorgaben befolgen. Fügen Sie außerdem Plasmide mit den Zieltranskriptionsfaktoren hinzu, unterstützt durch die bereitgestellten Sequenzierungsergebnisse.

(3) Probenverdopplung: Vermeiden Sie die Einrichtung doppelter Proben für denselben Transkriptionsfaktor. Wenn eine Verdopplung notwendig ist, ist es ratsam, zwei bis drei doppelte Proben einzurichten und das Verdopplungsexperiment gleichzeitig durchzuführen.

(4) Vorbereitung der analysierten Informationen: Stellen Sie ausgereifte genomische Informationen zusammen, einschließlich der genomischen fa-Datei, der gff-Datei und der pep.fa-Datei, die auf die untersuchte Art zugeschnitten sind.

Anmerkungen: Theoretisch können alle pflanzlichen Transkriptionsfaktoren undergo. DAP-seqDie Machbarkeit von Nicht-Pflanzenproben wird ebenfalls berücksichtigt. Da DAP jedoch hauptsächlich für Pflanzen-Expressionssysteme entwickelt wurde, sind die nachfolgenden Ergebnisse für Nicht-Pflanzenproben nicht garantiert. Es ist wichtig zu beachten, dass Proteine von Nicht-Transkriptionsfaktoren keiner Machbarkeitsanalyse unterzogen werden können und die Zuverlässigkeit der nachfolgenden Ergebnisse nicht gewährleistet ist.

• Spezifische Schritte

Die primären Schritte umfassen DNA-Bibliothekskonstruktion, Proteinexpression, Bindungsreaktionen zwischen dem Protein und der Bibliothek, Bibliotheks-PCR mit Spleißung und quantitativer Detektion, Online-Sequenzierung und Rohdatenanalyse.

(1) Gesamte genomische DNA-Extraktion und Bibliothekskonstruktion:

- Beginnen Sie mit der Extraktion der gesamten genomischen DNA aus dem Gewebematerial.

- Anschließend erstellen Sie die DNA-Bibliothek.

(2) Konstruktion von In-vitro-Expressionsplasmiden für Transkriptionsfaktoren

- Entwickeln Sie das Halo-Tag in vitro Expressionsplasmid für Transkriptionsfaktoren.

- Nutzen Sie das Weizenembryosystem zur Proteinexpression.

(3) Protein-Bibliotheksinteraktion und Anreicherung

- Kombinieren Sie das Protein und die Bibliothek.

- Verwenden Sie magnetische Perlen, um DNA-Fragmente anzureichern, die an das Zielprotein gebunden sind.

(4) Waschen und komplexe Reinigung

- Führen Sie mehrere Wäschen durch, um unspezifisch gebundenes Chromatin zu eliminieren.

- Reinigen Sie den resultierenden Komplex.

(5) DNA-Fragmentreinigung, Sequenzierung und Rohdatenanalyse

- DNA-Fragmente reinigen.

- Führen Sie eine Sequenzierungsanalyse auf einer Online-Plattform durch.

- Rohsequenzierungsdaten auf bedeutungsvolle Erkenntnisse analysieren.

DAP-seq-Datenanalyse

• Qualitätskontrolle und Datenfilterung

Die erste Verarbeitung umfasst die Qualitätskontrolle und Filterung von Rohdaten, die Behandlung gemeinsamer Probleme und die Eliminierung von Daten niedriger Qualität.

Die nachfolgende Qualitätskontrolle gewährleistet die Zuverlässigkeit, indem sie die gefilterten sauberen Daten genau überprüft.

• Vergleich von Referenzgenomsequenzen

Nutzen Sie saubere Daten, um einen umfassenden Vergleich mit der Referenzgenomsequenz durchzuführen.

Identifizieren Sie die genomischen Standorte, an denen die sequenzierten Reads zugeordnet sind.

• Peak-Erkennung und Bam-Dateigenerierung

Generieren Sie eine BAM-Datei nach dem Vergleich.

Verwenden Sie Software, um die Peak-Erkennung auf der BAM-Datei durchzuführen und signifikante Leseakkumulationen zu identifizieren, die die Bindungsorte der untersuchten Transkriptionsfaktoren anzeigen.

• Spitzenanalyse

Führen Sie eine detaillierte Analyse der erhaltenen Peaks durch, wobei Faktoren wie Peak-Anzahl, Länge, Genomverteilung und Verteilung über genfunktionale Elemente berücksichtigt werden.

• Funktionale Annotation und Anreicherungsanalyse

Wenden Sie GO- und KEGG-Anmerkungen auf Gene an, die mit den Peaks assoziiert sind, um deren Funktionen zu entschlüsseln.

Führen Sie eine Anreicherungsanalyse durch, um Einblicke in die funktionale Bedeutung dieser Gene zu gewinnen.

Vorhersage von Transkriptionsfaktoren bei Pflanzen und Tieren, die mit den Genen assoziiert sind, um zusätzliche Verständnisdimensionen zu bieten.

• Motivanalyse

Ein entscheidender Schritt umfasst die Motivanalyse, um potenzielle Bindungsmerkmale von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren.

Vorhersage von Motiven zur Verbesserung des Verständnisses der Bindungseigenschaften von Transkriptionsfaktoren, um eine anschließende Validierung zu erleichtern.

Bioinformatik-Workflow von DAP-Seq – CD Genomics

Integrierte Transkriptom- und DAP-seq-Analyse in der Pflanzenforschung

Im Bereich der Pflanzenwissenschaften gibt es ein wachsendes Interesse an der Kombination von Transkriptomanalyse und DAP-seq-Technologie um komplexe biologische Prozesse zu entschlüsseln. Dieser neuartige Ansatz beinhaltet die Nutzung des Transkriptoms, um intergruppenspezifische Genunterschiede zu identifizieren. Gleichzeitig, DAP-seq wird eingesetzt, um die spezifischen Gene zu untersuchen, die von Transkriptionsfaktoren angesteuert werden, und damit das umfassende regulatorische Netzwerk zu erhellen.

Diese integrierte Analyse bietet ein ganzheitliches Verständnis, indem sie die Bindungsziele von Transkriptionsfaktoren mit dem Auftreten von differentiell exprimierten Genen und deren daraus resultierenden funktionalen Unterschieden verknüpft. Nachfolgende biologische Experimente, wie Gen-Knockdown oder Überexpression, dienen als Validierungswerkzeuge. Durch die Korrelation von Daten aus diesen beiden genomischen Perspektiven wird eine synergetische Vertiefung der Transkriptomforschung erreicht. Dieser umfassende Ansatz liefert Einblicke in das regulatorische Ausdrucksnetzwerk von Genen und beleuchtet deren upstream-regulatorische Mechanismen.

Bitte beziehen Sie sich auf unseren Artikel. Wie man DAP-Seq für Transkriptionsfaktorstudien an Nicht-Modellorganismen verwendet? für einen Fall.

Die Verbindung zwischen diesen beiden Methoden dreht sich um die Orientierungen von Transkriptionsfaktoren und ihren jeweiligen Zielgenen.

• Identifizierung von Transkriptionsfaktoren

Funktionale Transkriptionsfaktoren zeigen sich oft in RNA-Seq-Daten, die unterschiedliche Expression zwischen Proben oder den Status von Kerngenen innerhalb des Genregulationsnetzwerks aufweisen.

Transkriptionsfaktoren, die diese Kriterien erfüllen, werden zu Kandidaten für eine weitergehende Untersuchung und dienen als entscheidende Ziele für nachfolgende DAP-seq Experimentaufbau.

• Zielgenentdeckung

Die durch DAP-seq extrahierten Informationen enthüllen die DNA-Sequenz-Erkennungspräferenzen von Transkriptionsfaktoren und legen somit potenzielle Bindungsstellen offen.

Die Vorhersage der regulatorischen Beziehung zwischen Transkriptionsfaktoren und Zielgenen ist möglich, indem man diese potenziellen Bindungsstellen nutzt.

Die Validierung des tatsächlichen Einflusses von Zielgenen auf den Phänotyp erfolgt auf transkriptioneller Ebene und wird durchgeführt durch RNA-Seq-Daten.

Die Übereinstimmung der Ergebnisse aus diesen beiden Methoden identifiziert oft das endgültige Zielgen, das zum beobachteten Phänotyp beiträgt, und bietet ein umfassendes Verständnis der transkriptionalen Regulation.