CRISPR-Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen

Das CRISPR-Cas9-System

Das CRISPR-Cas9-Gen-Targeting-System, das aus zwei Komponenten besteht: einer maßgeschneiderten Leit-RNA (sgRNA, die eine ziel-spezifische crRNA-Sequenz und tracrRNA enthält) und einer unspezifischen CRISPR-assoziierten Endonuklease (Cas9), ist ein neues Werkzeug zur Genom-Engineering, das es Wissenschaftlern ermöglicht, Teile des Genoms zu modifizieren, indem sie einen Abschnitt der DNA-Sequenz in einem Organismus entfernen, hinzufügen oder ändern. Es ist derzeit die am stärksten vereinfachte, flexible, präzise und effiziente Methode der genetischen Manipulation, mit zahlreichen Anwendungen in der Medizin und der Verbesserung von Pflanzensamen. CRISPR-Cas9 hat auch die Erzeugung gezielter Mutationen revolutioniert, indem es hochdurchsatzfähiges Genome Editing ermöglicht.

Einführung in die CRISPR-Sequenzierung

Im CRISPR-Experimentationsprozess ist die Validierung von Editierungen besonders wichtig. Da Off-Target-Mutationen auftreten können, anstatt Editierungen im Zielgen, ist die Next-Generation-Sequenzierung (NGS eine einfache und hochdurchsatzfähige Technik, um bevorzugte Mutationen zu überprüfen. Für die Wissenschaft, Kliniken und die Industrie ist die CRISPR-Amplicon-Sequenzierung zu einer standardisierten Validierungsmethode geworden. Die Idee des hochdurchsatzfähigen CRISPR-Screenings konzentriert sich auf die gezielte Amplicon-Sequenzierung, die mithilfe von PCR-Experimenten mit Primern, die den fokussierten Bereich umschließen, durchgeführt wird. Die empfindlichste Technik zur Überprüfung von Mutationen ist die gezielte Amplicon-Sequenzierung, die Erkennungsraten von bis zu 0,01 % aufweist.

Abbildung 1. CRISPR-basierte Anreicherungsstrategien für gezielte Sequenzierung. (Schultzhaus, 2020)

CRISPR-Sequenzierung kann direkte und umfassende Daten über die Art und Vielfalt der Mutationen bereitstellen, wie z. B. die Bestätigung von Knockout-/Knockin-Allelen, die Bewertung der Schneideeffizienz von sgRNA, die Identifizierung von homozygoten und heterozygoten Varianten, die Berechnung von Mutationsfrequenzen usw.

CRISPR-Sequenzierungs-Workflow

Die DNA-Isolation, PCR-Experimente, Deep-Sequencing und Datenanalyse sind alle Teil des CRISPR-Mutations-Sequenzierungs-Workflows. Forscher können die CRISPR-Mutations-Sequenzierung nutzen, um die Leitbibliothek zu verifizieren, CRISPR/Cas9-Ziele und Mutationseffizienz zu bewerten und die vielversprechendsten Zielstandorte zu finden.

Schritt 1Design - Wählen Sie ein Cas-Enzym aus und erstellen Sie eine Leit-RNA.

Schritt 2Lieferung - Es wird empfohlen, das Cas-Enzym und die Leit-RNA zu kombinieren, um ein Ribonukleoprotein (RNP) zu bilden, das das Cas-Enzym und die Leit-RNA in die Zellen liefert. Elektroporation oder Lipofektion kann dann verwendet werden, um das RNP in die Zellen zu bringen. Um die Transfektionseffizienz zu verbessern, können separate Elektroporation-Enhancer für Cas9 und Cas12a eingesetzt werden.

Schritt 3Reparatur - Cas9- oder Cas12a-haltige RNPs schneiden die genomische DNA und verursachen einen Doppelstrangbruch (DSB). Nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und homologe gerichtete Reparatur (HDR) sind natürliche Prozesse in Zellen. Der NHEJ-Weg kann verwendet werden, um Knockouts zu erstellen, um die Genfunktion zu untersuchen. HDR erfordert nicht nur RNP, um den DSB zu erzeugen, sondern auch einen Bauplan, um die Reparatur zu leiten, und kann eingesetzt werden, um spezifische Mutationen einzuführen.

Schritt 4Analysieren - Je nach Ihren Forschungsbedürfnissen können Sie verschiedene Methoden zur Erkennung von Mutationen verwenden. Gelbasierte Methoden können verwendet werden, um das Vorhandensein einer Transition in einer genomischen Sequenz auf unspezifische Weise zu bestimmen. Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) wird dringend empfohlen, um den Erfolg der gezielten Bearbeitung zu bestätigen und off-target Effekte zu untersuchen.

Anwendungen

Die CRISPR-Cas9-Technologie hat die Fähigkeit zur Modifikation von DNA und zur Modulation der Expressionsniveaus von interessierenden Genen revolutioniert und bietet effektive Werkzeuge, um die präzise Ingenieurarbeit an einer Vielzahl von Organismen zu beschleunigen. Darüber hinaus kann das CRISPR-Cas-System genutzt werden, um "Präzisions"-Antimikrobielle zu schaffen, die bakterielle Krankheitserreger basierend auf ihrer DNA-Sequenz gezielt angreifen. Durch die selektive Zielsetzung von Genen, die mit Antibiotikaresistenz, Biofilmbildung und Virulenz assoziiert sind, wird es möglich sein, arzneimittelresistente Mikroben abzutöten.

Referenzen:

1. Schultzhaus Z, Wang Z, Stenger D. CRISPR-basierte Anreicherungsstrategien für gezielte Sequenzierung. Biotechnologie-Fortschritte. 2020 Nov 28:107672.
2. de la Fuente-Núñez C, Lu TK. CRISPR-Cas9-Technologie: Anwendungen in der Genom-Engineering, Entwicklung von sequenzspezifischen Antimikrobiellen und zukünftige Perspektiven. Integrative Biologie2017, 1. Februar; 9(2).
3. Selle K, Barrangou R. CRISPR-basierte Technologien und die Zukunft der Lebensmittelwissenschaft. Zeitschrift für Lebensmittelwissenschaft2015 Nov;80(11).
4. Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, u. a.Eine aktualisierte evolutionäre Klassifikation der CRISPR–Cas-Systeme. Nature Reviews Mikrobiologie. 2015 Nov;13(11).