Was ist CITE-Seq?

CITE-seq (zelluläre Indizierung von Transkriptomen und Epitopen) stellt einen Durchbruch in der Einzelzell-Sequenzierung dar, da es die gleichzeitige Erfassung von Transkripten und einem Teil der Membranoberflächenproteine ermöglicht. Diese innovative Methode ergänzt die traditionelle Einzelzell-RNA-Sequenzierung von 10X Genomics, indem sie die Detektion von Zelloberflächenproteinen integriert. Statistische Analysen zeigen eine starke Korrelation zwischen der RNA- und der ADT-basierten Zellkategorisierung, was auf einen minimalen Signalverlust bei der ADT-Detektion hinweist und somit eine genaue Identifizierung von Zellklassen erleichtert. Besonders vorteilhaft für Analysen mit einer hohen Zellzahl, die anfällig für Mehrdeutigkeiten sind, verbessert CITE-seq die Fähigkeit, zwischen Zelltypen zu unterscheiden, ohne die Signalintegrität zu beeinträchtigen.

Gleichzeitig ermöglicht die Zell-Hashing-Tagging-Technologie die Realisierung von Multi-Proben-Mischungen für die CITE-seq-Detektion, gefolgt von der Aufspaltung von Einzelzell-Daten. Dies erleichtert die anschließende Identifizierung und Charakterisierung von Zelllinien und durch Antikörper erfassten Oberflächenproteinen, wobei jeweils HTO- oder ADT-Tag-Sequenzen genutzt werden.

Vorteile von CITE-Seq

• Vielseitigkeit bei der Proteindetektion: CITE-seq bietet die Möglichkeit, über 100 Oberflächenproteine gleichzeitig zu detektieren und integriert sich nahtlos in kommerzielle Plattformen. Dies überwindet die Einschränkungen der Flusszytometrie und bietet eine unbegrenzte Auswahl an Antikörpern.
• Verbesserte Zelltypisierung: CITE-seq ermöglicht eine klarere Identifizierung von Zelltypen, erleichtert die Annotation seltener Zelltypen und fördert die Entdeckung neuer Zellunterpopulationen.
• Dropout-Minderung: Die Integration mit der Zell-Hashing-Labeling-Technologie behebt effektiv das Dropout-Problem und verbessert die Datenqualität.
• mRNA- und Protein-Integration: CITE-seq ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von Multi-Omics innerhalb derselben Zelle und bietet simultane Informationen zu mRNA und Zelloberflächenproteinen. Dieser umfassende Ansatz übertrifft die traditionelle Einzelzell-RNA-Sequenzierung in Bezug auf die Informationsdichte.

Darüber hinaus bietet 10X Genomics ein etabliertes ADTs-gekoppeltes Markierungssystem und einen detaillierten Verfahrensrahmen für CITE-seq. Durch die Nutzung der Feature Barcode-Technologie führt es effizient Transkriptom- und Oberflächenproteinstudien in Immunzellen durch. Darüber hinaus ermöglichen kompatible Produkte wie oligonukleotid-gekoppelte Antikörper und oligonukleotid-gekoppelte MHC eine umfassende Einzelzell-Multi-Omics-Analyse.

Anwendungen von CITE-Seq

CITE-seq dient als ein leistungsstarkes Werkzeug zur Integration von Proteininformationen mit Genen und unterstützt die präzise Charakterisierung von Zellzuständen.

Die Weighted Nearest Neighbor (WNN) Analyse-Methode stellt einen anspruchsvollen Ansatz zur Harmonisierung von Multi-Omics-Daten innerhalb einzelner Zellen dar und liefert somit eine umfassende Definition des Zellzustands. Diese Methode arbeitet auf unüberwachter Basis und berechnet zunächst zellspezifische histologische Gewichte durch Kreuzvorhersage über mehrere Omics-Schichten. Diese Gewichte, die die relative Bedeutung jeder histologischen Informationskomponente erfassen, informieren anschließend die Distanzmetrik zwischen Zellen, was zur Konstruktion eines WNN-Nachbarschaftsgraphen führt – dem WNN-Graphen – der die Multi-Omics-Landschaft innerhalb einzelner Zellen darstellt. Der WNN-Graph findet Anwendung in verschiedenen nachgelagerten Analyseaufgaben in der Einzelzell-Datenanalyse, einschließlich UMAP-Visualisierung, Clusteranalyse und der Konstruktion von zytomimetischen Zeitreihen.

• Zellidentitätsbestimmung

Ursprünglich wurden RNA-Daten einzeln verarbeitet, während RNA+ADT-Daten gemeinsam mit dem Weighted Nearest Neighbor (WNN)-Ansatz analysiert wurden. Die Annotation unter Verwendung klassischer Marker zeigte, dass die Einbeziehung von ADT-Daten während der Analyse zu einer verbesserten Differenzierung und Annotation einer breiteren Palette von Zelltypen führte. Besonders bemerkenswert war, dass die Einführung der ADT-Down-Konversion deutlichere Unterschiede zwischen T-Zell-Subpopulationen im Vergleich zu RNA allein aufzeigte. Die Kombination von RNA- und ADT-Gewicht-Violin-Diagrammen innerhalb jedes Zelltyps wies erhöhte ADT-Gewichte innerhalb von Makrophagen (MPs) und T-Zell-Subpopulationen auf. Die Integration von ADT zur Dimensionsreduktion zeigte eine verbesserte Unterscheidung zwischen Subpopulationen im Vergleich zu RNA allein und bot umfangreiche Proteinvalidierung sowie die Identifizierung kritischer Oberflächenmarker für jede Subpopulation. Frühere Studien haben bestätigt, dass CITE-seq die Populationsauflösung verbessert, indem es ähnliche Subpopulationen effektiv unterscheidet und sogar neuartige PD-L1/PD-L2+-Makrophagenpopulationen aufdeckt, die mit klinischen Ergebnissen korreliert sind.

• Untergruppenabgrenzung

Anschließend wurden die Abgrenzung und Validierung von Subpopulationen der scRNA-seq-Ergebnisse durchgeführt. Angesichts der höheren Proteinwerte, die in T-Zellen beobachtet wurden, wurde eine weitere Unterteilung der T-Zell-Subpopulationen angestrebt. Die Validierung der durch scRNA identifizierten Subpopulationen anhand der CITE-seq-Ergebnisse zeigte eine ausgeprägtere Trennung der Subpopulationen in UMAP-Diagrammen basierend auf Protein-Daten. Violin-Plots von RNA- und ADT-Gewichten hoben die Rolle der Proteinausdrücke bei der Unterscheidung von Subpopulationen während der Unterteilung der T-Zellen hervor. Darüber hinaus erleichterte eine umfangreiche Proteinvalidierung die Identifizierung wichtiger Oberflächenmarker für jede Subpopulation.

• Mechanismusforschung durch funktionale Analyse

Eine weitere Unterteilung der NK-Subgruppen zeigte, dass die Einbeziehung von ADT-Features eine bessere Subgruppendiskriminierung ermöglichte, wobei unter den Subgruppen unterschiedliche Proteinmarkerausdrücke beobachtet wurden. Zum Beispiel wies Cluster 1 eine spezifische Expression des CD8a-Proteinmarkes auf, während Cluster 5 eine signifikante Anreicherung im NK-Zell-vermittelten Toxizitätsweg zeigte. Bemerkenswerterweise gab es keine signifikanten Unterschiede in der CD8A-Genexpression zwischen den Clustern.

Fallstudie: Einzelzellanalyse der Leber

In einem bahnbrechenden Vorhaben hat das Forschungsteam die Einzelzell-CITE-seq mit komplementären Technologien kombiniert, um das räumliche Proteom von Einzelzellen der menschlichen und Mausleber zu kartieren und Licht auf die lipidassoziierte Makrophagenpopulation zu werfen. Bei der Untersuchung der mRNA- und Proteinexpression auf Einzelzellebene wurden 18 Proben einer CITE-seq unterzogen und anschließend analysiert, was zur effektiven Identifizierung von 17 verschiedenen Zelltypen führte. Gleichzeitig erfasste das Antikörpererkennungssystem von CITE-seq geschickt Kupffer-Zellen, und durch sorgfältige Analyse der Zellpopulationen trat das VSIG4-Protein als der herausragende Marker für menschliche Kupffer-Zellen im CITE-seq-Datensatz hervor.

Ein proteogenomisches Atlas der gesunden murinen Leber. (Guilliams et al., 2022)

Eine Population von Makrophagen befindet sich um den Gallengang in der gesunden murinen Leber. (Guilliams et al., 2022)

Fallstudie: Einzelzelluntersuchung von Lungenkrebs

Diese Studie präsentiert eine umfassende Analyse der bisher größten Kohorte von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) unter Verwendung von Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und CITE-seq-Methoden. Durch die Untersuchung der Immunantworten, die unter den Patienten geteilt werden, identifizierte die Forschung gemeinsame Faktoren und deckte unterschiedliche immunmodulatorische Effekte der Tumormutationslast und TP53-Mutationen auf. Infolgedessen wurden verfeinerte Modelle entwickelt, um die Reaktionen auf Immuntherapien mit größerer Genauigkeit vorherzusagen.

Die transkriptionale Landschaft des Tumormikroumfelds wurde sorgfältig durch scRNA-seq- und CITE-seq-Analysen untersucht, wobei ein Spektrum transkriptionaler Zustände offenbart wurde.

Insbesondere hoben CITE-seq-Daten einzigartige Eigenschaften von CD8+ T-Zellen hervor, die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) ähneln, und zeichneten T-Zell-Subtypen sowohl in normalen als auch in krebserkrankten Geweben nach. Bemerkenswerterweise wiesen Tumorgewebe eine breitere Palette von T-Zell-Subtypen auf, die aktivierende, zykliche und regulatorische T-Zellen umfassten.

Durch die Nutzung von Erkenntnissen aus CITE-seq-Daten und anderen Einzelzell-Multi-Omics-Untersuchungen wurde eine Einzelzell-Immune-Reaktionskarte für Lungenkrebs erstellt. Diese Karte skizzierte eine Signatur der Immunaktivierung und identifizierte das Zusammenspiel zwischen tumorassoziierten antigenen Lasten und Treibermutationszuständen. Darüber hinaus wurde ein Modell entwickelt, das die LCAM-Achse nutzt und ein direkteres Maß für die Antigenspezifität und die anti-tumorale Immunaktivierung bietet. Dieses verfeinerte Modell verspricht eine verbesserte Präzision bei der Definition der Immunaktivierung innerhalb antigen-spezifischer Tumoren.

scRNA-seq und CITE-seq zeigen die Vielfalt der transkriptionalen Zustände im Tumormikroumfeld. (Leader et al., 2021)

Referenzen

1. Guilliams, Martin, et al. "Räumliche Proteogenomik zeigt unterschiedliche und evolutionär konservierte hepatische Makrophagen-Nischen." Zelle 185.2 (2022): 379-396.
2. Leader, Andrew M., et al. "Einzelzellanalyse von menschlichen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Läsionen verfeinert die Tumorklassifikation und Patientenstratifizierung." Krebszelle 39.12 (2021): 1594-1609.