Was sind Antibiotikaresistenzgene (ARGs)?

Ein Resistenzgen bezeichnet eine Nukleotidsequenz (DNA-Fragment), die für die Kodierung eines Merkmals verantwortlich ist, das eine Arzneimittelresistenz verleiht. Ähnlich wie andere genetische Materialien unterliegen diese Gene während der bakteriellen Teilung und Proliferation der Replikation. Diese antibiotikaresistenten Gene können sich im bakteriellen Chromosom oder auf Plasmiden außerhalb des Chromosoms befinden. Besonders bemerkenswert ist, dass Resistenzgene auf Plasmiden zwischen Stämmen derselben Bakterienart oder sogar zwischen verschiedenen Arten durch Mechanismen wie Spleißen, Transformation und Transduktion übertragen werden können.

Im Jahr 2017 identifizierte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) 12 besonders bedrohliche "Superkeime" und unterstrich damit das globale Auftreten von bakterieller Antibiotikaresistenz als ein wichtiges Anliegen der öffentlichen Gesundheit.

Fortschritte in Sequenzierungstechnologien und die Entwicklung der Bioinformatik haben zur weitverbreiteten Anwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken im Bereich der Erkennung bakterieller Antibiotikaresistenz geführt. Bemerkenswerte Methoden umfassen Whole-Genome-Sequenzierung (WGS), Metagenomische Sequenzierung (mNGS)und mikrobielles Einzelzell-Transkriptom-Sequencing, auch bekannt als mikrobielles Einzelzell-RNA-Sequencing.

Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen (ARGs). (Rice et al., 2020)

Die verschiedenen Arten von Resistenzgenen

Resistenzgene, basierend auf den Antibiotika, die Resistenz induzieren, können in mehrere Typen kategorisiert werden. Dazu gehören Tetracyclin-Resistenzgene (tet), Sulfonamid-Resistenzgene (sul), β-Lactamase-Resistenzgene (bla), Makrolid-Resistenzgene (erm), Aminoglykosid-Resistenzgene (aac), Fluorchinolon-Resistenzgene (fca), Colistin-Resistenzgene (mcr), Vancomycin-Resistenzgene (van) und Multidrug-Resistenzgene (mdr).

Die globale Verbreitung von arzneimittelresistenten Genen in der Umwelt hat erhebliche Bedenken aufgeworfen. Primäre Reservoirs für arzneimittelresistente Stämme und Gene befinden sich im Darmtrakt und im Kot von Nutztieren und Geflügel, was die weitreichende Übertragung dieser Gene erleichtert. Mobile genetische Elemente (MGEs) spielen eine entscheidende Rolle bei dieser Verbreitung und umfassen wesentliche Entitäten wie Insertionsequenzen, Transposons, Integrons, Plasmide und integrative Splice-Elemente.

Horizontaler Gentransfer dient als ein Schlüsselmechanismus für die Übertragung von arzneimittelresistenten Genen und erfolgt durch drei gängige genetische Prozesse:

• Spleißen (Plasmid-vermittelt): Bezieht sich auf den Transfer genetischen Materials durch Plasmide.
• Natürliche Transformation (Bakterielle Aufnahme von DNA aus der Umwelt): Wenn Bakterien DNA direkt aus ihrer Umgebung aufnehmen.
• Transduktion (Vermittelt durch Phagen): Ermöglicht durch Bakteriophagen, die als Träger genetischen Materials zwischen Bakterien fungieren.

Das Verständnis dieser Mechanismen ist entscheidend, um die Herausforderung der Proliferation antibiotikaresistenter Gene anzugehen und effektive Strategien zu entwickeln, um ihre Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit und die Umwelt zu mindern.

Mechanismen der Antibiotikaresistenz

Antibiotikaresistenzgene (ARGs), die Antibiotikaresistenz kodieren, sind ein intrinsisches Phänomen, das der menschlichen Einwirkung vorausgeht. Bakterien zeigen Resistenz durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Antibiotika-Exkretion, Undurchlässigkeit der Zellmembran, Modifikation von Antibiotikazielen und der Synthese von Antibiotika-Hydrolasen. Besonders Aminoglykoside, die durch zahlreiche Makromoleküle mit exponierten Hydroxyl- und Amidgruppen gekennzeichnet sind, sind besonders anfällig für Modifikationen, was zu hohen Resistenzniveaus führt.

Jüngste Fortschritte haben neuartige Resistenzmechanismen enthüllt, einschließlich der Rolle des ABC-F-Proteins im Antibiotika-Wettbewerb, Mutationen, die essentielle Gene außer Kraft setzen, und die Förderung von Resistenzen unter herausfordernden Umweltbedingungen. Diese Erkenntnisse vertiefen unser Verständnis der dynamischen und sich entwickelnden Landschaft der Antibiotikaresistenz und betonen das komplexe Zusammenspiel zwischen Bakterien und ihrer Reaktion auf selektive Drücke.

Überblick über die molekularen Mechanismen der Antibiotikaresistenz. (Darby et al., 2023)

Erkennung von bakteriellen Resistenzgenen basierend auf Hochdurchsatz-Sequenzierung

• Whole Genome Sequenzierung (WGS)

WGS ist der umfassende Prozess der Entschlüsselung der gesamten genetischen Sequenz einer bestimmten Art. Im Bereich der Erkennung von bakterieller Arzneimittelresistenz, WGS emergiert als ein leistungsstarkes Werkzeug, das ein umfassendes Profil von Arzneimittelresistenzgenen innerhalb von Bakterien bietet. Es geht über die bloße Identifizierung hinaus und ermöglicht die Vorhersage von Arzneimittelresistenzphänotypen, indem die Komplexität der Arzneimittelresistenzgene analysiert und die damit verbundenen Resistenzmechanismen entschlüsselt werden. Zahlreiche Studien haben Vergleiche zwischen WGS und phänotypische AST zur Erkennung bakterieller Arzneimittelresistenz, die konsequent die Präzision von WGS bei der Vorhersage bakterieller Arzneimittelresistenz demonstriert.

Darüber hinaus spielt die WGS eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Antibiotikaresistenzgenen, die sowohl in Chromosomen als auch in Plasmiden innerhalb der Genome von antibiotikaresistenten Bakterien vorhanden sind. Dieses Wissen trägt erheblich zum Verständnis der Dynamik hinter der Bewegung und Verbreitung von Resistenzgenen bei. Darüber hinaus dient die WGS als wertvolles Werkzeug zur Überwachung von Ausbrüchen und Epidemien von antibiotikaresistenten Stämmen. Trotz dieser Vorteile ist es wichtig zu beachten, dass die WGS bestimmte Nachteile hat, darunter eine längere Testdauer, höhere Kosten und die Notwendigkeit reiner bakterieller Kulturen. Diese Faktoren tragen zu den erhöhten Anforderungen bei, die mit der Identifizierung und Isolierung klinischer Bakterien unter Verwendung dieser Technik verbunden sind.

Versammlung versus Lesezuordnung. (Boolchandani et al., 2019)

• Metagenomische Next-Generation Sequenzierung (mNGS)

mNGS ist ein hochmodernes Verfahren, das entwickelt wurde, um die genomischen Informationen von mikrobiellen Populationen innerhalb spezifischer Umweltproben durch Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie zu enthüllen. Durch die Nutzung bioinformatischer Analysemethoden erleichtert mNGS die Identifizierung von Krankheitserregern, die Analyse von Mikrobiomen, Studien zu Wirt-Interaktionen und die Vorhersage von bakterieller Arzneimittelresistenz. Im Bereich der klinischen Erkennung von Genen für bakterielle Arzneimittelresistenz tritt mNGS als leistungsstarkes Werkzeug hervor, das in der Lage ist, Infektionen zu diagnostizieren, die durch unbekannte Krankheitserreger verursacht werden, und damit verbundene Resistenzen gegen Arzneimittel aufzudecken. Diese Informationen dienen als wertvolle Referenz für die gezielte Anwendung von Antibiotika in klinischen Einrichtungen.

In einer bemerkenswerten Studie verwendeten Wang et al. die mNGS-Technologie, um Klebsiella pneumoniae in kultivierungsnegativen Lungengewebeproben von einem immungeschwächten Patienten mit schwerer Pneumonie zu identifizieren. Die Analyse ergab zudem Resistenzgene wie blaSHV-12, blaKPC-2, blaTEM-1und blaCTX-M-65Zusätzlich, mNGS hat sich als entscheidend bei der Entdeckung neuer Resistenzgene erwiesen, die 11 zuvor unbekannte Antibiotika-Resistenzgene aus Bodenproben identifiziert haben. Dazu gehörten neuartige Ampicillin-Resistenzgene, Gentamicin-Resistenzgene, Chloramphenicol-Resistenzgene und Meclobutanil-Resistenzgene.

Ein wesentlicher Vorteil von mNGS liegt in seiner unvoreingenommenen Erkennung von Antibiotikaresistenzgenen direkt aus Originalproben, was die Suche nach neuartigen Antibiotikaresistenzgenen neben dem Screening bestehender Gene ermöglicht. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass diese Technologie mit inhärenten Herausforderungen verbunden ist, darunter hohe Kosten, Komplexität und das Fehlen eines standardisierten und automatisierten Analyseprozesses. Diese Faktoren stellen Hürden für das großflächige Screening von bakteriellen Arzneimittelresistenzgenen dar.

• Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) revolutioniert unser Verständnis von Zellpopulationen, indem sie das Transkriptom einzelner Zellen entschlüsselt, Populationsvariationen aufdeckt und evolutionäre Beziehungen offenbart. In den letzten Jahren hat sich die mikrobielle Einzelzell-RNA-Sequenzierung als eine fortschrittliche Technologie etabliert, die die Prinzipien der scRNA-seq speziell auf Mikroorganismen, wie bakterielle Zellen, anwendet.

Die Entwicklung von MscRNA-seq steht vor Herausforderungen aufgrund des niedrigen mRNA-Gehalts von Mikroorganismen, der charakteristischen Zellwand- und Membraneigenschaften bestimmter Bakterien sowie des Fehlens von mRNA-Polyadenylierung. Diese technischen Barrieren haben historisch den Fortschritt der mikrobiellen scRNA-seq behindert. Das Forschungsteam von Georg Seelig an der Universität Washington hat jedoch einen Durchbruch erzielt, indem es die microSPLiT-Sequenzierung von mikrobiellen Einzelzelltranskriptomen unter Verwendung der auf Split-Pool-Ligation basierenden Transkriptom-Sequenzierungstechnologie (SPLiT-seq) bei Bakterien einsetzte.

Mikrobielle SPLiT-seq stellt einen bedeutenden Fortschritt dar, da es die erste kostengünstige, hochdurchsatzfähige Methode zur Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung von Bakterien ist. MicroSPLiT, das barcode-markierte RNA-Quellen aus bakteriellen Zellen nutzt, kann in einem einzigen Experiment zehntausende von bakteriellen Zellen analysieren.

Mit der Weiterentwicklung der mikrobiellen scRNA-seq-Technologie werden Herausforderungen wie niedriger mRNA-Gehalt, zelluläre Vielfalt und komplexe Zellwandstrukturen erfolgreich angegangen. Ihre Anwendung erstreckt sich auf das Mining des Transkriptoms von arzneimittelresistenten Genen in klinischen Superbugs. Durch das umfassende Verständnis der Expression und des Transfers von arzneimittelresistenten Genen hat die mikrobielle scRNA-seq entscheidende Bedeutung für die Verbesserung der Erkennung und Screening klinischer Multidrug-Resistenzen.

Zusammenfassung

Traditionelle Methoden zur Erkennung bakterieller Resistenzen bieten wertvolle phänotypische Einblicke in bakterielle Resistenzen, sind jedoch durch lange Kultur- und Charakterisierungszeiten eingeschränkt und können Resistenzen gene nicht identifizieren. Neuartige Technologien, die auf physikalischen, chemischen und molekularbiologischen Methoden basieren, bieten Vorteile wie einen kürzeren Erkennungszyklus und eine erhöhte Sensitivität bei der Erkennung bakterieller Arzneimittelresistenzen. Diese Methoden stoßen jedoch an Grenzen bei der Erkennung unbekannter Resistenzen und mutierter Gene.

Die Ankunft von hochdurchsatzsequenzierungsbasierte Nachweistechnologien dient als ergänzender Ansatz, der die Lücke zwischen klassischer phänotypischer Detektion und molekularen Methoden überbrückt. Diese fortschrittliche Technologie zeichnet sich durch die präzise Identifizierung bakterieller Resistenzgene aus, entdeckt neue Resistenzgene und lokalisiert Mutationsstellen. In Zukunft wird die Integration von phänotypischer und genotypischer Detektion bei bakterieller Arzneimittelresistenz entscheidend sein, um arzneimittelresistente bakterielle Infektionen zu kontrollieren und Epidemien zu bewältigen. Dieser ganzheitliche Ansatz bietet innovative technische Unterstützung für die Prävention und Überwachung verwandter Infektionskrankheiten.

Referenzen:

1. Rice, Eric W., et al. "Bestimmung der Wirte von Antibiotikaresistenzgenen: eine Übersicht über methodische Fortschritte." Umweltwissenschaften & Technologie Briefe 7,5 (2020): 282-291.
2. Boolchandani, Manish, Alaric W. D'Souza und Gautam Dantas. "Sequenzierungsbasierte Methoden und Ressourcen zur Untersuchung der antimikrobiellen Resistenz." Nature Reviews Genetics 20.6 (2019): 356-370.
3. Darby, Elizabeth M., et al. "Molekulare Mechanismen der Antibiotikaresistenz neu betrachtet." Nature Reviews Mikrobiologie 21.5 (2023): 280-295.