Anwendung der RAD-Sequenzierungstechnologie

Aufgrund seiner leistungsstarken Fähigkeit, genomische Variationen umfassend zu erkennen, hat die RAD-Sequenzierungstechnologie in mehr als 20 Tier- und Pflanzenarten, die kein Referenzgenom besitzen, Anwendung gefunden. Ihre Anwendungen umfassen die Etablierung genomischer Marker, genetische und vergleichende Kartierung, hochauflösende Kartierung von merkmalsassoziierten Genen und QTLs (Quantitative Trait Loci), Untersuchungen in der Populationsgenetik und Evolution sowie umfassende genomweite Assoziationsstudien. Darüber hinaus bietet die RAD-Sequenzierung für Arten mit Referenzgenomen, insbesondere für solche mit größeren Genomen, eine erhebliche Kostenreduktion bei der Sequenzierung im Vergleich zur Neusequenzierung des gesamten Genoms. Dieser Vorteil wird besonders deutlich, wenn große Stichprobengrößen erforderlich sind für Bevölkerungsgenetikuntersuchungen.

Entwicklung von molekularen Markern

In Arten ohne ein Referenzgenom umfasst der Prozess zur Gewinnung molekularer Marker typischerweise die Suche nach Polymorphismen unter Verwendung zuvor veröffentlichter Marker aus derselben Art oder eng verwandten Arten. Alternativ kann die Sequenzinformation dieser Marker und die konservierten Gensequenzen von eng verwandten, sequenzierten Arten für die Entwicklung von Markern genutzt werden. Marker, die mit diesen Ansätzen erzeugt werden, bestehen häufig aus SSR-Markern mit begrenztem Polymorphismus, was die Gestaltung zahlreicher Primer erforderlich macht, um eine kleine Anzahl polymorpher Marker zu erhalten.

Im Gegensatz dazu bietet die RAD-Sequenzierungstechnologie bemerkenswerte Vorteile für die Markerentwicklung, indem sie die Entdeckung zahlreicher ermöglicht. SNPs durch das gesamte Genom hinweg durch Sequenzierung. Im Vergleich zu SSR-MarkerSNPs sind dicht im Genom verteilt. Darüber hinaus ist RAD-Sequenzierung sowohl zeit- als auch kosteneffizient, was zu erheblichen Einsparungen bei Arbeits- und Ressourcenaufwendungen führt.

Genetische Karte von Weizen mit verschiedenen Markern

Genetische und vergleichende Kartenkonstruktion

Traditionell war die Erstellung von Ganzgenom-Genkarten unter Verwendung von PCR-Markern ein Prozess, der durch arbeitsintensive, ressourcenintensive und zeitaufwändige Aspekte gekennzeichnet war, hauptsächlich aufgrund der Notwendigkeit der individuellen Genotypisierung jedes Markers innerhalb segregierender Populationen durch PCR-Elektrophorese. Die Einführung der RAD-Sequenzierungstechnologie für die Eltern und ihre segregierenden Populationen hat jedoch diese Praxis revolutioniert und ermöglicht die schnelle Erfassung einer großen Anzahl von SNP-Genotypen, die eine umfassende Abdeckung des gesamten Genoms für den Bau genetischer Karten bieten.

Genetische Karten mit erhöhter Marker-Dichte und Abdeckung bieten eine reichhaltigere Auswahl an Loci und Regionen für die vergleichende Genomik-Analyse. Folglich ermöglicht dieser Ansatz ein umfassenderes und detaillierteres Verständnis des Genoms sowie makroökonomische Einblicke in Kollinearitätsbeziehungen im Vergleich zu eng verwandten Arten mit bekannten Sequenzen. Bemerkenswert ist, dass diese Methode deutliche Vorteile bei der Erkennung und Charakterisierung struktureller Variationen wie Inversionen, Deletionen und Translokationen bietet.

Hochauflösende Merkmalsgen-/QTL-Kartierung

Botaniker und Forscher im Bereich der genetischen Züchtung sind sehr daran interessiert, den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp zu entschlüsseln. Die Entdeckung der Gene/QTLs (Quantitative Trait Loci), die Zielmerkmale steuern, erfordert eine hochauflösende genetische Kartierung. Je höher die Präzision der Kartierung, desto vorteilhafter wird sie nicht nur für die anschließende Klonierung von Genen/QTLs, sondern auch für die markergestützte Züchtung von Zielgenen.

Die anfängliche Kartierung von Genen/QTLs erfordert ein Screening über das gesamte Genom. Für qualitative Merkmalsgene wird häufig die Bulked Segregant Analyse (BSA) eingesetzt, während die vorläufige Kartierung von QTLs das Scannen des Genoms mithilfe einer umfassenden genetischen Karte erfordert. Traditionelle genetische Karten, die mit PCR-Markern erstellt werden, weisen eine unterschiedliche Marker-Dichte im gesamten Genom auf. Wenn ein Zielgen sich in einem Bereich mit niedriger Marker-Dichte befindet (z. B. keine Marker innerhalb von etwa 30 cM genetischer Distanz), kann es schwierig sein, verknüpfte Marker durch PCR-Selektion zu erhalten. Eine unzureichende Marker-Dichte beeinträchtigt ebenfalls die Genauigkeit der QTL-Kartierung.

Über die Genauigkeit der Kartierung hinaus, die SNP-Sequenz Daten, die aus RAD-Sequenzierung abgeleitet sind, eignen sich für vergleichende Analysen mit den Genomsequenzen eng verwandter Arten. In Fällen, in denen die SNPs innerhalb des kartierten Bereichs in den kodierenden Regionen von interessierenden Genen liegen, können statistische Analysen eingesetzt werden, um diese SNP-Varianten zu bewerten. Diese Analyse kann aufdecken, welche Gene nicht-synonyme Substitutionen oder vorzeitige Terminierungen zwischen den Elternstämmen erfahren haben. Solche Erkenntnisse bieten einen wertvollen Referenzrahmen für die Vorhersage von Kandidatengen und können die anschließenden Validierungen der Genfunktion erleichtern.

Populationsgenetische Analyse und GWAS

Die Anwendung der RAD-Sequenzierungstechnologie in der Populationsgenetik und Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) beinhaltet hauptsächlich die Sequenzierung und Identifizierung von Varianten in natürlichen Populationen der Zielart. Es umfasst die statistische Analyse von Variantenstandorten innerhalb dieser Populationen, die Untersuchung der Populationsstruktur und die Identifizierung von Loci im Genom, die der Selektion unterliegen.

Gleichzeitig identifiziert es in Kombination mit Phänotypdaten SNPs, die eng mit Zielmerkmalen assoziiert sind. Die anschließende gemeinsame Analyse ausgewählter Loci und SNPs, die aus GWAS gewonnen wurden, erleichtert die Untersuchung der Beziehung zwischen künstlicher Selektion und Populationsentwicklung.

Referenzen:

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