Eine umfassende Untersuchung von Methoden zur Analyse von Integrationsstellen

Gen- und Zelltherapie

Im Jahr 1990 erzielte W.F. Anderson, ein Pionier der amerikanischen Medizin, einen bahnbrechenden Erfolg im Bereich der Gentherapie. Seine transformative Arbeit beinhaltete die Anwendung von Gentherapie bei einem 4-jährigen Mädchen, das an einer Adenosin-Deaminase-Defizienz litt, und markierte einen historischen Moment als den ersten weltweiten Triumph in der Gentherapie sowie einen entscheidenden Meilenstein in der Medizingeschichte. In den folgenden Jahrzehnten unermüdlicher Entwicklung hat sich die Gentherapie als ein Hoffnungsträger etabliert und bietet einen Paradigmenwechsel im Ansatz zur Behandlung von Krankheiten, indem sie diese an ihren genetischen Wurzeln angeht.

Kategorisch entfaltet sich die Gentherapie in zwei distincten Behandlungsmodi. Die In-vivo-Therapie umfasst die direkte Injektion von Vektoren, die die erforderlichen Gene tragen, in den Blutkreislauf oder spezifische Zielorgane. Diese Methode findet Anwendung in den Bereichen monogenetischer Erkrankungen, Hämophilie und ophthalmologischen Erkrankungen. Auf der anderen Seite beinhaltet die In-vitro-Therapie, die als Zelltherapie anerkannt ist, die Entnahme von Zellen eines Patienten, die genetische Modifikation außerhalb des Körpers und die anschließende Wiedereinführung in das System des Patienten. Eine bemerkenswerte Ausprägung der In-vitro-Therapie ist die CAR-T-Zelltherapie (Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy), ein hochmodernes, präzisionsgerichtetes Verfahren, das eine neue Ära in der Tumorbehandlung einläutet.

Der Fortschritt zeigt sich in der Genehmigung von über 20 Gentherapie-Arzneimitteln und 8 CAR-T-Produkten durch nationale Arzneimittelzulassungsbehörden. Ausgestattet mit fortschrittlicher Biotechnologie und vielversprechenden therapeutischen Ansätzen sind Gentherapie- und Zelltherapie-Medikamente bereit, eine entscheidende Rolle in der zukünftigen Landschaft der Krankheitsprävention und -behandlung zu spielen.

Die Analyse der Integrationsstellen von Lentiviren durch CD Genomics nutzt die Leistungsfähigkeit der Illumina-Plattform zur Erkennung von Integrationsstellen und hat einen kostengünstigen, hochdurchsatzfähigen Ansatz entwickelt, indem Sequenzierung mit Zielanreicherung oder die LM-PCR-Methode verwendet wird. Wir freuen uns, unsere umfangreiche Erfahrung und unsere fortschrittliche Plattform einzusetzen, um den besten Service und die qualifiziertesten Produkte anzubieten, um jede Nachfrage unserer Kunden zu erfüllen.

Integrationsstandort-Analyse-Workflow – CD Genomics

Lentivirale Integration in der Gen- und Zelltherapie

Im Bereich der Gen- und Zelltherapie spielen der Modus und die Wirksamkeit der Genübertragung eine entscheidende Rolle für die therapeutische Wirkung des Medikaments. Folglich hat die Auswahl eines geeigneten Vektors von größter Bedeutung. Lentivirale Systeme haben aufgrund ihres breiten Infektionsspektrums, der geschickten Infektion sowohl von sich teilenden als auch von nicht teilenden Zellen und der langfristigen und stabilen Expression exogener Gene eine weitverbreitete Anwendung in verschiedenen therapeutischen Anwendungen gefunden.

Virale Integration steht als ein entscheidender Aspekt des standardmäßigen lentiviralen Lebenszyklus. Der Prozess beginnt damit, dass das Virus einen Rezeptor auf der Oberfläche der Wirtszelle erkennt, was den Transfer von RNA und Proteinen in die Zelle erleichtert. Anschließend unterliegt die RNA der reversen Transkription zu DNA, und die Integrase erkennt die Long Terminal Repeat (LTR), die von der viralen DNA getragen wird. Sie schneidet dann das Wirtsgenom auf zufällige oder semi-zufällige Weise, was zu klebrigen Enden führt, die nahtlos mit der viralen DNA verschmelzen und die Einfügung des exogenen Gens abschließen. Die virale Integration erweist sich als ein unverzichtbarer Schritt für die Expression exogener Gene und die Verwirklichung der therapeutischen Effekte der Gentherapie.

Methoden zur Analyse von Integrationsstellen

• PCR-Technologie

Ursprünglich umfasste die Analyse viraler Integrationen Southern Blot und genomische Bibliotheken zur Charakterisierung von Integrationsstellen. Im Laufe der Zeit hat die PCR den Southern Blot als primäre Analysemethode für virale Integrationen aufgrund ihrer betrieblichen Einfachheit und Ergebnisgenauigkeit abgelöst. Im Bereich der PCR-Technologie sind drei Hauptkategorien für die Analyse viraler Integrationen entstanden: Reverse PCR (R-PCR), Ligationsvermittelte PCR (LM-PCR)und Linear Amplifikation Mediierte PCR (LAM-PCR).

Bei der Reverse-PCR wird DNA enzymatisch gespalten und dann in eine Schleife ligiert. Reverse-Primer werden für die Amplifikation entworfen, um die Retrieval unbekannter Sequenzen auf beiden Seiten der viralen Integrationsstelle zu ermöglichen. Allerdings schränkt die begrenzte Effizienz der Ligase-Schleifenbildung die Nützlichkeit der Reverse-PCR ein.

LM-PCR umfasst das Verbinden der beiden Enden von DNA nach der Spaltung und Unterbrechung, mit Primern, die auf festen Sequenzen von viraler DNA und Verbindungen basieren. Dieser Ansatz eröffnet die Positionsinformationen des Integrationsorts des Virus. LM-PCR ist bekannt für seine Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit und wird seit seiner Einführung bis heute verwendet.

LAM-PCR stellt eine fortschrittlichere Technik dar, bei der DNA zunächst linear amplifiziert wird, und das aus dieser Amplifikation gewonnene einzelsträngige Produkt wird durch LM-PCR weiter amplifiziert, um das spezifische Produkt der einzelsträngigen Amplifikation zu erhalten. Die Einführung der linearen Amplifikation erhöht die Sensitivität und Spezifität von LAM-PCR, die die von Reverse PCR und LM-PCR übertrifft, was es zu einer weit verbreiteten Methode in der aktuellen Forschung macht.

Schematische Darstellung von LAM-PCR zur Amplifikation von 5'-LTR retroviralen Vektor-genomischen Fusionssequenzen. (Schmidt et al., 2007)

• Next-Generation Sequencing (NGS)

der Hochdurchsatz-Sequenzierung. Next-Generation-Sequenzierung (NGS) als die vorherrschende Technologie für integrative Standortanalysen. NGS erweitert aufgrund seiner umfangreichen Sequierungsdaten erheblich das Spektrum der Integrationsstandorte. Besonders gut eignet es sich zur Erkennung von Integrationsklonen mit niedriger Frequenz und liefert wertvolle Einblicke für die Arzneimittelentwicklung.

Der Prozess der Konstruktion von Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken ist komplizierter im Vergleich zur traditionellen PCR. Zu den häufig verwendeten Methoden zur Bibliothekskonstruktion gehören LM-PCR, LAM-PCR und nicht-restriktive Enzymverdau-LAM-PCR. Während die LAM-PCR-Bibliothekskonstruktion die Komplexität und hohen Kosten im Zusammenhang mit biotinmarkierten Primern und streptavidinmarkierten magnetischen Perlen in der linearen Amplifikation umfasst, erweist sich die LM-PCR als pragmatische Alternative. Die LM-PCR erleichtert die Anreicherung von Einfügungsstellensequenzen durch einen zweistufigen PCR-Prozess, der die Bibliothekskonstruktion in 6-7 Stunden ermöglicht. Dieser optimierte Ansatz beschleunigt den Zyklus der Bibliothekskonstruktion und macht ihn zu einer optimalen Methode zur Detektion von lentiviralen Einfügungsstellen.

Lentiviren besitzen lange terminale Sequenzen (5'LTR und 3'LTR) an jedem Ende, und LM-PCR kann beide LTRs amplifizieren, um Bibliotheken zu bilden. In herkömmlichen Methoden zur Bibliothekskonstruktion werden jedoch die Hälfte der nachgelagerten Datenlesungen redundante Informationen über die Integration von LTRs mit proviralen Sequenzen. Daher hebt sich die Anpassung von LM-PCR als eine effiziente und ideale Wahl zur Erkennung von Lentivirus-Einfügungsstellen hervor.

Referenz:

1. Schmidt, M., Schwarzwaelder, K., Bartholomae, C. u. a. Hochauflösende Analyse von Einfügungsstellen durch linear amplifizierte PCR (LAM-PCR). Nat Methoden 4, 1051–1057 (2007).