Ein Leitfaden zur Ganzexomsequenzierung bei Krebs

Whole Exome Sequenzierung (WES) hat sich als transformative Kraft herauskristallisiert, die die umfassende Analyse der kodierenden Regionen von Genen, die mit Krankheiten und der Evolution von Populationen verbunden sind, ermöglicht. In Kombination mit den umfangreichen Exomdaten, die in öffentlichen Datenbanken verfügbar sind, wird WES zu einem mächtigen Werkzeug, um die komplexen Zusammenhänge zwischen genetischen Varianten, Krankheiten und den zugrunde liegenden Mechanismen zu entschlüsseln. Während seine Anwendungen vielfältig sind, leuchtet die Anwendung von WES in der Krebsforschung am hellsten aufgrund ihrer Komplexität und der beispiellosen Möglichkeiten, die sie bietet, um einen der herausforderndsten Feinde der Menschheit zu bekämpfen.

Von Gewebe zu Daten – Schritte der gesamten Exomsequenzierung. (Bartha et al., 2020)

Probenanforderungen und DNA-Extraktion: Grundlagen einer genauen Analyse

Durchführung Krebs-Ganzexom-Sequenzierung (CWES) erfordert eine sorgfältige Auswahl der Proben und die DNA-Extraktion, um die Genauigkeit und Relevanz der Ergebnisse sicherzustellen. Tumorgewebe, formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Proben und peripheres Blut sind die gängigen Probenarten. Ein entscheidender Aspekt von CWES ist jedoch die Paarung von Tumorproben mit passenden Normalproben. Diese Paarung mindert nicht nur den Einfluss des genetischen Hintergrunds, sondern ermöglicht auch die Identifizierung somatischer Mutationen, die einzigartig für den Tumor sind.

Der Prozess der DNA-Extraktion ist eine empfindliche Kunst, die darauf abzielt, die Integrität der DNA zu bewahren und gleichzeitig Kontaminanten zu entfernen. Er umfasst eine Reihe von Schritten wie Zelllyse, enzymatische Behandlung, Trennung der Nukleinsäuren und Reinigung. Besonders die Herausforderungen, die durch FFPE-Proben entstehen, erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die durch Formaldehyd induzierte Vernetzung, die Bildung von DNA-Addukten und Modifikationen, die zu falsch positiven Ergebnissen führen, unterstreichen die Notwendigkeit eines strategischen Ansatzes im Umgang mit solchen Proben.

Meisterung der Bibliothekskonstruktion: Technische Nuancen

Der Bau von Bibliotheken in CWES ist ein multidimensionales Unterfangen, bei dem Präzision von größter Bedeutung ist. Mehrere technische Aspekte müssen sorgfältig behandelt werden, um genaue und zuverlässige Sequenzierungsergebnisse zu gewährleisten.

• Optimierung der Effizienz der Fragmenttransformation
  Der Erfolg des Bibliotheksaufbaus hängt von der Erreichung einer hohen Fragmenttransformationseffizienz ab – also der Umwandlung einer maximalen Anzahl von Ausgangs-DNA-Fragmenten in messbare Bibliotheksfragmente. Ein entscheidender Faktor für den Erfolg ist die Komplexität der Bibliothek, die sich in einer reichhaltigeren Sequenzierungsdatenabdeckung der Zielregionen niederschlägt. Dies erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung der Ausgangs-DNA-Menge, -qualität und der Fragmentumwandlungseffizienz. Strenge Tests und Bewertungen sind unerlässlich, um eine optimale Fragmenttransformationseffizienz zu erreichen.
• Hintergrundgeräusche zähmen
  Im komplexen Tanz von Next-Generation Sequencing (NGS)Fehler schleichen sich ein, und Hintergrundgeräusche verwässern das Signal. Hintergrundgeräusche entstehen aus verschiedenen Quellen, einschließlich PCR-Fehlern, Sequenzierungsungenauigkeiten und komplexen genomischen Regionen. Dies zu beheben erfordert Einfallsreichtum – einzigartige molekulare Tags, die während der Bibliothekskonstruktion an DNA-Fragmente angeheftet werden, fungieren als Wächter und helfen, echte Mutationen von fehlerhaften Signalen zu unterscheiden. Diese clevere Strategie reduziert effektiv das Hintergrundgeräusch und erhöht die Genauigkeit der Mutationsdetektion.
• Kontamination widerstehen
  Das Gespenst der Probenkreuzkontamination verfolgt den Bibliotheksaufbau und stellt eine ernsthafte Bedrohung für die Richtigkeit der Ergebnisse dar. Falsch platzierte Etiketten oder Datenüberschneidungen während der Analyse können die Ergebnisse verzerren. Um dem entgegenzuwirken, ist der Einsatz von Double-End-Indexierung während des Bibliotheksaufbaus unerlässlich. Besonders relevant auf Plattformen wie Illumina, wo Index-Hopping auftreten kann, schützt dieser Ansatz vor Probenkreuzkontamination und wahrt die Integrität der Ergebnisse.
• Neutralisierung von Amplifikationsbias
  Genomische Regionen sollten im endgültigen Sequenzierungsdatensatz gleichmäßig vertreten sein, um eine bevorzugte Amplifikation und verzerrte Einsichten zu vermeiden. Dieses Gleichgewicht zu erreichen, erfordert die Auswahl eines hochgenauen Enzyms und die sorgfältige Kalibrierung der PCR-Amplifikationszyklen. Durch die Minimierung von Amplifikationsverzerrungen entsteht ein genaueres Bild genetischer Varianten.

Datenanalyse: Entwirrung des genetischen Gewebes

Die Datenanalysephase ist der Ort, an dem die wahre Kraft von CWES wird genutzt. Es umfasst das Entschlüsseln der komplexen genomischen Veränderungen, die das Fortschreiten von Krebs vorantreiben, und die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele.

• Variantenpriorisierung
  Die Durchsicht der umfangreichen Varianten erfordert eine strategische Priorisierung. Varianten werden basierend auf ihrer funktionalen Auswirkung, Häufigkeit in Datenbanken und Relevanz für die Krebsbiologie klassifiziert. Pathogene und wahrscheinlich pathogene Varianten haben Vorrang als potenzielle Treibermutationen.
• Funktionale Annotation und Pathway-Analyse
  Funktionale Annotationswerkzeuge entschlüsseln die potenziellen Folgen identifizierter Varianten. Die Vorhersage ihrer Auswirkungen auf die Proteinstruktur und -funktion hilft, ihre Rolle in der Karzinogenese zu bewerten. Die Analyse von Signalwegen kontextualisiert diese Varianten und hebt veränderte Signalwege hervor, die für die Krebsentwicklung entscheidend sind.
• Integration mit klinischen Daten
  Die Verbindung von genomischen Erkenntnissen mit klinischen Daten schafft ein umfassendes Patientenprofil. Die Patientenanamnese, die Reaktion auf Behandlungen und die Ergebnisdaten leiten die Identifizierung von umsetzbaren Mutationen und potenziellen Behandlungsstrategien. Diese Integration bildet die Grundlage für die präzise Onkologie, die Therapien an die einzigartige genetische Landschaft eines Patienten anpasst.

Referenz:

1. Bartha, Áron und Balázs Győrffy. "Algorithmen zur Analyse von Whole-Exome-Sequenzierungsdaten in der Krebsdiagnostik." (2020).