Ribosomen-Profiling: Definition, Anwendungen, Prinzipien und Arbeitsablauf

Was ist Ribosomen-Profiling?

Ribosomen-Profiling, auch bekannt als Ribo-seq, ist eine neu entwickelte Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnik, die auf der Sequenzierung von ribosomen-geschützten mRNA-Fragmenten basiert. Ribosomen-Profiling ermöglicht die detaillierte und genaue Messung der zellulären Translation, sogar in vivo. Ribo-seq ermöglicht die Überwachung von zellulären Translationsprozessen, die Bestimmung aktiv übersetzter Proteine in einer Zelle und die Vorhersage der Proteinmenge, wodurch das Proteom komplexer Organismen definiert werden kann. Darüber hinaus kann Ribo-seq Einblicke in die Mechanismen der translationalen Regulation geben. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um regulatorische Translationspausen und übersetzte upstream-ORFs zu erkennen und Translationsprozesse zu überwachen, die von Teilmengen von Ribosomen vermittelt werden. Ribosomen-Profiling ist die erste Methode, die für die Annotation von übersetzten offenen Leserahmen (ORFs) verfügbar ist und hat die Entdeckung vieler neuartiger oder alternativer Proteinprodukte ermöglicht.

Anwendungen des Ribosomen-Profilings:

• Identifizierung übersetzter Sequenzen innerhalb des komplizierten Transkriptoms
• Kartierung von Initiationsstellen der Translation
• Messung der differentiellen Genexpression auf der Ebene der mRNA-Translation
• Identifizierung neuartiger protein-codierender Gene und Ribosomen-Pausen
• Bereitstellung von Daten für quantitative Modelle der Translation
• Einblicke in die Mechanismen der Proteinsynthese, der Translationskontrolle und des Prozesses der Virusinfektion

Prinzipien des Ribosomen-Profilings

Ribosomen-Profiling nutzt den Vorteil, dass Ribosomen, die an der Translation beteiligt sind, etwa 30 Nukleotide eines mRNA-Fragmentes gegen RNAse-Abbau schützen können. Diese Technik nutzt zunächst die klassische molekulare Methode des Ribosomen-Footprintings. In dieser Methode werden in vitro übersetzte mRNAs mit Nuklease behandelt, um ungeschützte Regionen zu zerstören. Die durch das Ribosom geschützten mRNAs können auf die ursprüngliche mRNA zurückgeführt werden, um den genauen Standort des übersetzenden Ribosoms zu bestimmen. Ribosomen-Profiling erweitert die Methode des Ribosomen-Footprintings, indem es das vollständige Spektrum der Ribosomen-Footprints kartiert und misst, um neuartige Proteinsynthese zu quantifizieren und kodierende Regionen global zu annotieren. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie ermöglichen eine tiefgehende und genaue Analyse aller übersetzenden Ribosomen durch mRNA-seq.

Workflow des Ribosomen-Profilings

Das auf Next-Generation-Sequencing (NGS) basierende Ribosomen-Profiling erfordert die Vorbereitung einer physiologischen Probe, in vivo Erfassung von übersetzenden Ribosomen und mRNAs, Lyse, Nuklease-Abbau (typischerweise RNase I oder mikrokozzale Nuklease), um ribosomen-geschützte Fragmente zu erhalten, Isolation von Ribosomen und anschließend Ribosomen-Footprints, die in eine strangspezifische Bibliothek umgewandelt und NGS unterzogen werden. Die Sequenzen der Fragmente werden dann gegen das entsprechende Referenzgenom kartiert. Ribosomen-Profiling liefert genomweite Informationen zur Proteinsynthese (GWIPS) in vivo.

Durch den Vergleich der Raten der Proteinsynthese und der Menge an mRNAs kann die translationale Effizienz für jede mRNA bestimmt werden.

Abbildung 1. Workflow für Ribosomen-Profiling (Brar und Weissman 2015).

Literaturverzeichnis:

1. Brar G A, Weissman J S. Ribosomen-Profiling zeigt das Was, Wann, Wo und Wie der Proteinsynthese. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2015, 16(11): 651-664.
2. Ingolia N T. Ribosomen-Profiling: neue Ansichten der Translation, von einzelnen Codons bis zur Genomgröße. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(3): 205-213.