Nanopore Direkt-RNA-Sequenzierungsprotokoll

Poly(A) Tailing-Reaktion

1. 17 μl RNA in einem PCR-Röhrchen wird 2 Minuten bei 65 °C inkubiert und sofort auf Eis gelegt, um die Bildung sekundärer Strukturen zu vermeiden.
Fügen Sie 3,5 μl 10× E. coli Poly(A) Polymerase Reaktionspuffer zu 17 μl RNA in einem PCR-Röhrchen hinzu und bringen Sie es auf Raumtemperatur.
3. Fügen Sie 4,5 μl ATP in das PCR-Röhrchen hinzu, gefolgt von 4 μl E. coli Poly(A) Polymerase und 1 μl RNase-Inhibitor in das PCR-Röhrchen.
4. Mischen Sie vorsichtig mit einer P200-Pipette und inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 10 Minuten.
5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie direkt mit dem Reinigungsschritt der Perlen fortfahren. Mischen Sie die Agencourt RNAClean XP Perlen gut, sodass das Reagenz homogen und gleichmäßig gefärbt erscheint. Fügen Sie 60 μl der homogenen Agencourt RNAClean XP Perlen in das PCR-Röhrchen hinzu und mischen Sie gut mit einem P200-Pipetten. Inkubieren Sie für 5 Minuten.
6. Stellen Sie das PCR-Röhrchen für 2 Minuten in den Magnetständer.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
8. Waschen Sie die RNA zweimal mit 80% Ethanol, indem Sie 180 μl 80% Ethanol hinzufügen und 1 Minute inkubieren. Entfernen Sie dann das Ethanol, ohne das Pellet zu stören.
9. Bei Raumtemperatur 2 Minuten an der Luft trocknen (bis es trocken, aber nicht rissig ist).
10. Eluieren Sie mit 12 μl nukleasefreiem Wasser und schütteln Sie das Röhrchen. Inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Stellen Sie das PCR-Röhrchen für 2 Minuten in das Magnetständer.
Pipettiere 11 μl poly(A) tailiertes RNA in ein neues PCR-Röhrchen und lege das Röhrchen auf Eis.
13. Messen Sie die endgültige RNA-Konzentration (optional).

dRNA-seq

1. Adapter-Ligation: Mischen Sie 3,0 μl NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer mit poly(A)-beschichtetem RNA, gefolgt von 1,0 μl RT-Adapter (RTA) und 1,5 μl T4-DNA-Ligase. Mischen Sie durch Pipettieren und zentrifugieren Sie. Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Rücktranskription: Bereiten Sie den Rücktranskriptions-Mastermix vor, indem Sie 9,0 μl nukleasefreies Wasser, 2,0 μl 10 mM dNTPs, 8,0 μl 5x First-Strand-Puffer und 4,0 μl 0,1 M DTT mischen. Fügen Sie den Mastermix in das PCR-Röhrchen mit der RT-Adapter-ligierten RNA hinzu. Mischen Sie mit einer 200 μl Pipette. Fügen Sie 2 μl SuperScript IV Rücktranskriptase zur Reaktion hinzu. Platzieren Sie das Röhrchen in einem Thermocycler und inkubieren Sie es bei 50 °C für 10 Minuten, dann bei 70 °C für 10 Minuten und bringen Sie die Reaktion auf 4 °C.
3. RNA-Reinigung mit 80% Ethanol: Vortexieren Sie die Agencourt RNAClean XP Perlen, um sie wieder in Suspension zu bringen. Fügen Sie 72 μl der resuspendierten Agencourt RNAClean XP Perlen zur reversen Transkriptionsreaktion hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Probe und pelletieren Sie sie auf einem Magnetständer für 3 Minuten. Lassen Sie das Röhrchen auf dem Magneten und pipettieren Sie das Überstand ab. Waschen Sie die RNA zweimal mit 180 μl 80% Ethanol. Entfernen Sie das 80% Ethanol mit einer Pipette und entsorgen Sie es. Zentrifugieren Sie und stellen Sie das Röhrchen wieder auf den Magneten. Pipettieren Sie jegliches verbleibendes 70% Ethanol ab. Lassen Sie es bei Raumtemperatur 1 Minute lufttrocknen. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magnetständer und resuspendieren Sie das Pellet in 20 μl nukleasefreiem Wasser und schütteln Sie das Röhrchen. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur. Stellen Sie das Röhrchen wieder auf den Magneten für 1 Minute und pipettieren Sie 20 μl Eluat in ein neues 0,2 ml PCR-Röhrchen.
4. Motorprotein-Ligation: Fügen Sie 8,0 μl NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer zu den 20 μl eluierten, revers-transkribierten RNA hinzu. Fügen Sie dann 4,5 μl - 6,0 μl RNA-Adapter (RMX) gefolgt von 3,0 μl nukleasefreiem Wasser und 3,0 μl T4 DNA-Ligase hinzu. Mischen Sie mit einer 200 μl Pipette. Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur.
5. RNA-Reinigung mit Waschpuffer (WSB): Vortex die Agencourt RNAClean XP Perlen, um sie wieder in Suspension zu bringen. Füge 40 μl der resuspendierten Agencourt RNAClean XP Perlen zum Reaktionsröhrchen hinzu und mische durch Pipettieren. Inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugiere die Probe und pelletisiere sie auf einem Magnetständer für 3 Minuten. Halte das Röhrchen am Magneten und pipettiere die Überstände ab. Füge 150 μl des WSB zu den Perlen hinzu. Schließe den Röhrchenverschluss und schüttle das Röhrchen sanft. Zentrifugiere und stelle das Röhrchen wieder auf den Magneten. Entferne den WSB mit einer Pipette und entsorge ihn. Wiederhole das Hinzufügen und Entfernen des WSB. Pipettiere alle verbleibenden WSB-Reste ab. Entferne das Röhrchen vom Magnetständer und resuspendiere das Pellet in 20 μl Elutionspuffer und schüttle das Röhrchen sanft. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Stelle das Röhrchen für 2 Minuten oder bis das Eluat klar ist, wieder auf den Magneten. Pipettiere 20 μl des Eluats in ein neues 0,2 ml PCR-Röhrchen. Füge 17,5 μl nukleasefreies Wasser zur vorbereiteten RNA-Bibliothek hinzu und mische mit einer 200 μl Pipette. Das Gesamtvolumen beträgt 37,5 μl.
6. Priming und Befüllen der SpotON-Flusszelle: Mischen Sie die RNA Running Buffer (RRB), Flush Buffer (FB) und Flush Tether (FLT) Röhrchen gründlich durch Vortexen und zentrifugieren Sie sie, und halten Sie alle Lösungen bei Raumtemperatur. Um die Priming-Mischung für die Flusszelle vorzubereiten, fügen Sie 30 μl FLT direkt zu dem Röhrchen mit FB hinzu und vortexen Sie es. Drehen Sie die Abdeckung des Priming-Ports im Uhrzeigersinn, um den Priming-Port zu öffnen. Stellen Sie eine P1000-Pipette auf 200 μl ein und setzen Sie die Spitze in den Priming-Port ein. Drehen Sie das Rad, bis Sie ein kleines Volumen (20 μl gelbe Farbe) von Puffer in die Pipettenspitze sehen können. Laden Sie 800 μl der Priming-Mischung über den Priming-Port in die Flusszelle, wobei Sie die Einführung von Luftblasen vermeiden. Warten Sie 5 Minuten. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Bibliothek zum Laden vor.
(a) Mischen Sie in einem neuen PCR-Röhrchen 37,5 μl RRB und 37,5 μl RNA-Bibliothek in nukleasefreiem Wasser. Öffnen Sie vorsichtig die Abdeckung des SpotON-Anschlusses. Laden Sie 200 μl der Primermischung in den Primierungsanschluss (nicht den SpotON-Probenanschluss). Stellen Sie die 200-μl-Pipette auf 75 μl ein. Mischen Sie die vorbereitete Bibliothek, indem Sie sie vor dem Laden in den Probenanschluss mehrmals auf- und abpipettieren. Laden Sie alle 75 μl der Probe tropfenweise in den SpotON-Probenanschluss. Schließen Sie den SpotON-Anschluss, schließen Sie den Primierungsanschluss und schließen Sie den Deckel des MinION Mk1B.
7. Sequenzierung: Doppelklicken Sie auf das MinKNOW-Symbol auf dem Desktop, um die MinKNOW-GUI zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Neues Experiment" und füllen Sie die Informationen basierend auf Ihrem Experiment aus, wie z. B. Proben-ID/Name. Wählen Sie das RNA002-Kit aus. Klicken Sie auf "Lauf starten". Bei der Option zur Echtzeit-Basenanrufung stellen Sie sicher, dass der Computer über genügend Ressourcen verfügt, um ein MinION ohne Leistungseinbußen zu betreiben.

Referenz:

1. Wongsurawat T, Jenjaroenpun P, Nookaew I. Direkte Sequenzierung von RNA und Identifizierung von RNA-Modifikationen mittels Nanopore[M]//Funktionelle Genomik von Hefen: Methoden und Protokolle. New York, NY: Springer US, 2022: 71-77.