Metatranskriptomische Sequenzierungsprotokoll

RNA-Extraktion

RNA-Extraktion aus Boden oder Sediment

1. 0,5 g (nass) Boden werden in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
2. 0,5 ml Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Puffer und 0,5 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) (pH 8,0) werden zu jeder Extraktion hinzugefügt.
3. Schütteln Sie die Röhrchen in einem Perlenmühle-System für 30 Sekunden bei 5,5 m/s.
4. Die wässrige Phase wird durch Zentrifugation (16.000 × g) für 5 Minuten bei 4 °C getrennt.
5. Die wässrige Phase wurde zu einem gleichen Volumen Chloroform-Isopentylalkohol (24:1) hinzugefügt.
6. Die Probe wird 5 Minuten lang bei 4 °C mit 16.000 × g zentrifugiert.
7. DNA und RNA werden aus der wässrigen Schicht mit 2 Volumina von 30 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol 6000–1,6 M NaCl für 2 Stunden bei Raumtemperatur gefällt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 18000 × g, 4 °C für 10 Minuten.
8. Das Nukleinsäurepellet wird dann mit eisgekühltem 70% (Vol/Vol) Ethanol durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 Minuten gewaschen.
9. Die Nukleinsäure wird dann 15 Minuten an der Luft getrocknet, bevor sie in 1000 ml RNase-freiem Tris-EDTA-Puffer resuspendiert wird.
10. 100 ml der gesamten RNA sollten mit b-Mercaptoethanol, das zum RLT-Puffer hinzugefügt wird, gereinigt werden.
11. Die ungefähre RNA-Konzentration wird durch Spektrophotometrie bestimmt und auf die Integrität der rRNA überprüft. Die Integrität der rRNA wurde durch hochdefinierte, diskrete rRNA-Spitzen nachgewiesen, wobei der 23S rRNA-Peak 1,5–2 Mal höher war als der 16S rRNA-Peak.
12. DNA-Kontamination wurde aus den Gesamt-RNA-Proben entfernt, indem sie mit dem Turbo DNA-free-Enzym behandelt wurden.

RNA-Extraktion aus Meerwasser

1. Filtern Sie 10–15 L Meerwasser durch einen 140 mm Durchmesser, 1,6 mm GF/A Filter, um die Abundanz eukaryotischer Zellen zu reduzieren und den Anteil prokaryotischer Zellen zu maximieren.
2. Wenden Sie das Filtrat direkt auf einen 0,22 mm Sterivex-Filter an.
Nach der Filtration wurde jedes Sterivex trocken gepumpt und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
4. Nach dem Auftauen auf Eis fügen Sie 1,6 ml SET-Lysepuffer direkt auf die Sterivex mit einer 2,5 ml Spritze hinzu.
5. Fügen Sie 180 ml frisches Lysozym hinzu und verschließen Sie den Sterivex.
6. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten.
Fügen Sie 200 ml SDS hinzu.
Fügen Sie 55 ml frisches Proteinase K mit 20 mg/ml hinzu.
9. Inkubieren Sie bei 55 °C für 2 Stunden.
10. Ziehen Sie das Lysat in eine 5-ml-Spritze auf.
Fügen Sie 1 ml frisches SET-Puffer zu Sterivex hinzu und drehen Sie, um zu spülen.
12. Ziehen Sie die Spülpufferlösung in dieselbe 5 ml Spritze auf.
13. Fügen Sie das Lysat zu einem 15-ml-Röhrchen hinzu, das 2 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1), pH 8, enthält. Schütteln Sie vorsichtig, bis es gemischt ist, und zentrifugieren Sie dann bei 1.500 × g für 5 Minuten.
14. Fügen Sie 2 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu. Schütteln Sie vorsichtig, bis es gemischt ist, und zentrifugieren Sie bei 1500 × g für 5 Minuten.
15. Fügen Sie 2 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) hinzu. Schütteln Sie vorsichtig, bis es gemischt ist, und zentrifugieren Sie bei 1500 × g für 5 Minuten.
16. Dekantieren Sie die wässrige Phase in ein steriles und mit DEPC behandelten (falls RNA benötigt) 20-ml Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,5 V von 7,5 M Ammoniumacetat hinzu. Kurz mischen und dann 2,5 V reinen Ethanol hinzufügen.
17. Mischen und bei −20 °C für >1 h lagern (über Nacht ist in Ordnung).
Zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C und dekantieren Sie den Ethanol.
19. Fügen Sie 2 ml 80% Ethanol hinzu und spülen Sie das Röhrchen, zentrifugieren Sie dann bei 10.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C und dekantieren Sie das Ethanol, und wiederholen Sie den Vorgang.
20. Ethanol dekantieren und 15 Minuten kopfüber im Abzug stehen lassen.
21. Suspendieren Sie das Pellet in 200 ml mit DEPC-behandeltem sterilen Wasser. Lassen Sie es etwa 1 Stunde auf Eis stehen und klopfen Sie häufig mit den Fingern an die Wände des Röhrchens, um es auszuspülen.

mRNA-Anreicherungstechniken

1. Gesamte RNA wurde auf die subtraktive Hybridisierungsmethode angewendet, um rRNA von der mRNA zu entfernen. Die Anweisungen des Herstellers enthalten ausreichende Details zur Durchführung dieses Verfahrens.
mRNA wurde in 25 ml TE-Puffer eluierte.
3. Entfernen Sie kleine RNAs und kleine Verunreinigungen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das gereinigte mRNA wurde in 10 ml DEPC-behandeltem Wasser eluiert.
mRNA wurde dann mithilfe eines Enzyms mit zufälligen Primern gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Transkription mit zufälligen Primern in cDNA umgeschrieben.
5. Die cDNA wurde mit RNase behandelt, um Spuren von RNA-Verunreinigungen zu entfernen, und bei 37 °C für 20 Minuten inkubiert.
6. 1 ml cDNA wurde dann zufällig amplifiziert. Idealerweise wird diese Reaktion 10× durchgeführt, und anschließend werden diese Replikate zusammengeführt, um potenzielle zufällige Amplifikationsverzerrungen, die in der Technologie der multiplen Displacement-Amplifikation vorhanden sind, zu beseitigen.
7. Amplifizierte Proben werden mit S1-Nuklease bei 2 m/mg cDNA behandelt. Die Reaktion wird in dem bereitgestellten Puffer bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt, indem EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM hinzugefügt und anschließend gereinigt wird.
cDNA wurde verneblt und anschließend mit AMPure-Perlen gereinigt.
9. cDNA wurde dann sequenziert.

Referenz:

1. Gilbert J A, Laverock B, Temperton B, et al. Metagenomik[M]//Hochdurchsatz-Nächste-Generations-Sequenzierung. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 173-183.