Metagenomisches Sequenzierungsprotokoll

DNA-Extraktion

DNA-Extraktion aus Boden oder Sediment

1. Wiegen Sie 0,5 g Glasperlen in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen.
2. Wiegen Sie in dieses Röhrchen 0,5 g Boden oder Sediment, das zuvor mit einem sterilen Spatel homogenisiert wurde.
3. Fügen Sie 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 8 hinzu (verwenden Sie dies, um das Röhrchen mit der Probe zu spülen).
4. Fügen Sie 0,5 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol in das Röhrchen hinzu.
5. Bead-beaten bei 8.000 × g für 30 s, auf Eis legen für 30 s und wiederholen für weitere 30 s.
6. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 16.000 × g (4°C).
7. Übertragen Sie das Überstand in ein sauberes 2 ml Röhrchen.
8. Fügen Sie ein gleiches Volumen (~500 ml) Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und vortexen Sie, um zu mischen.
9. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 16.000 × g, bei 4°C.
10. Übertragen Sie das Überstand in ein neues 2 ml Röhrchen.
11. Fügen Sie das 2-fache Volumen von eisgekühltem 100% Ethanol und 1/10 Volumen Natriumacetat hinzu und mischen Sie. Für die RNA-Extraktion verwenden Sie das 2,5-fache Volumen von Ethanol.
12. Fällung für mindestens 1 Stunde im Gefrierschrank.
13. Zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 16.000 × g.
14. Pipettieren Sie die Flüssigkeit ab und entsorgen Sie sie, wobei Sie vorsichtig mit dem Pellet umgehen.
15. Waschen Sie mit 200 ml 70% Ethanol, vortexen Sie, um zu mischen.
16. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 16.000 × g.
17. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte und entfernen Sie das verbleibende Ethanol mit einer Pipette. Seien Sie vorsichtig mit dem Pellet.
18. Lufttrocknen für 10 Minuten. Resuspendieren Sie die Pellets in sterilem Wasser.

DNA-Extraktion aus Meerwasser

1. Filtern Sie 10-15 L Meerwasser durch einen 140 mm Durchmesser, 1,6 mm GF/A-Filter, um die Anzahl der eukaryotischen Zellen zu reduzieren und den Anteil der prokaryotischen Zellen zu maximieren.
2. Wenden Sie das Filtrat direkt auf einen 0,22 mm Sterivex-Filter an.
3. Nach der Filtration, pumpen Sie die Sterivex-Kartusche trocken und frieren Sie sie schnell in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei −80°C bis zur DNA-Isolation.
4. Tauchen Sie die Sterivex-Kartusche auf Eis auf.
5. Fügen Sie 1,6 ml SET-Lyse-Puffer direkt auf die Oberseite von Sterivex mit einer 2,5 ml Spritze mit einer 25G 5/8"-Nadel hinzu.
6. Fügen Sie 180 ml frisches Lysozym hinzu und verschließen Sie die Sterivex.
7. Inkubieren Sie bei 37°C für 30 Minuten unter kontinuierlicher Rotation in einem Hybaid-Ofen.
8. Fügen Sie 200 ml SDS (10% w/v) und 55 ml frisches Proteinase K (20 mg/ml) hinzu.
9. Inkubieren Sie bei 55°C für 2 Stunden mit kontinuierlicher Rotation in einem Hybaid-Ofen.
10. Entnehmen Sie das Lysat aus der Sterivex mit einer 5 ml Spritze.
11. Fügen Sie 1 ml frischen SET-Puffer zur Sterivex hinzu und rotieren Sie, um zu spülen.
12. Entnehmen Sie den SET-Puffer in dieselbe 5 ml Spritze.
13. Fügen Sie das Lysat in ein 15 ml Maxtract-Röhrchen mit 2 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1), pH 8, hinzu.
14. Schütteln Sie vorsichtig, bis es gemischt ist. Zentrifugieren Sie dann bei 1.500 × g für 5 Minuten.
15. Fügen Sie zusätzlich 2 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) hinzu. Schütteln Sie vorsichtig, bis es gemischt ist, und zentrifugieren Sie bei 1.500 × g für 5 Minuten.
16. Fügen Sie 2 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) hinzu. Schütteln Sie vorsichtig, bis es gemischt ist, und zentrifugieren Sie bei 1.500 × g für 5 Minuten.
17. Dekantieren Sie die wässrige Phase in ein steriles 20 ml Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,5 V von 7,5 M Ammoniumacetat hinzu. Kurz mischen und dann 2,5 V reines Ethanol hinzufügen.
18. Mischen und bei −20°C für >1 Stunde (über Nacht ist in Ordnung) stehen lassen.
19. Zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 30 Minuten bei 4°C und dekantieren Sie das Ethanol.
20. Fügen Sie 2 ml 80% Ethanol hinzu und spülen Sie das Röhrchen, dann zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 20 Minuten bei 4°C und dekantieren Sie das Ethanol.
21. Wiederholen Sie den obigen Waschschritt.
22. Dekantieren Sie das Ethanol und lassen Sie es 15 Minuten in der Abzugshaube umgedreht stehen.
23. Suspendieren Sie das unsichtbare Pellet in 200 ml sterilem Wasser. Lassen Sie es etwa 1 Stunde auf Eis stehen und klopfen Sie häufig mit den Fingern, um die Röhrenwände zu spülen.
24. DNA kann durch Visualisierung mittels Agarose-Gelelektrophorese oder durch Verwendung beliebiger standardmäßiger DNA-Quantifizierungstechniken quantifiziert werden.
25. Für die Pyrosequenzierung ist es notwendig, ~5 mg DNA zu haben, die diese Technik in Übermaß produzieren wird. Idealerweise sollte die DNA eine Konzentration von etwa 500 ng/ml haben.

Sequenzierung

1. Die DNA muss genau gemessen werden. Die ideale Menge beträgt 3-5 mg für eine Fragmentbibliothek, aber es ist möglich, mit weniger erfolgreich zu arbeiten. Sie muss auch ein angemessenes Molekulargewicht haben, um zufälliges Scheren zu maximieren.
2. Die DNA in einem Volumen von 100 ml wird mit 500 ml Nebelungs-Puffer gemischt, der mit dem Bibliothekskit geliefert wird. Die DNA wird durch Platzierung in einem Nebelungsgefäß und Anschluss an Stickstoffgas bei 30 psi für 1 Minute geschert.
3. Die DNA wird aus der Nebelungskammer zurückgewonnen und mit dem Kit des Herstellers gemäß den Anweisungen des Kits gereinigt, wobei 2,5 ml PB-Puffer verwendet und die DNA in 100 ml Elutionspuffer eluiert wird.
4. In diesem Stadium werden die kleinen Fragmente mit AMPure-Perlen entfernt. Eine kalibrierte Menge wird zur DNA hinzugefügt, sodass Material von weniger als 300 bp in Lösung bleibt. Die DNA mit höherem MW bindet an die Perlen, wird mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und durch Eluieren in 10 mM Tris-HCl pH 7,5 zurückgewonnen.
5. Die DNA wird (1 ml Aliquot) auf Größenverteilung überprüft.
6. Weitere Manipulationen sind alle im Bibliothekskit beschrieben. Die Enden der DNA werden poliert, die Adapter (mit oder ohne Barcodes) hinzugefügt, Fragmente mit Adaptern auf Dynal-Perlen ausgewählt und die Enden gefüllt. Die einzelsträngige Bibliothek wird durch Schmelzen von den Dynal-Perlen mit NaOH (0,125 N) gemäß den Anweisungen des Herstellers zurückgewonnen und mit einer MinElute-Säule gereinigt.
7. Die Bibliothek wird durch Ausführen auf einem RNA-Picochip bewertet.
8. Eine vorbestimmte Menge der Bibliothek wird verwendet, um eine Emulsions-PCR-Reaktion mit entweder dem großen oder kleinen Volumenkits einzurichten. Dies beinhaltet das Binden der DNA an Fangperlen, die spezifisch für einen der Adapter sind.

Referenz:

1. Gilbert J A, Laverock B, Temperton B, et al. Metagenomics[M]//High-Throughput Next Generation Sequencing. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 173-183.