MeDIP-Sequenzierungsprotokoll

DNA-Scherung

1. Extrahiere genomische DNA entsprechend den untersuchten Zellen oder Geweben.
2. Sonikatiere gereinigte genomische DNA.
3. Verdünnen Sie 6 μg genomische DNA in 130 μl (Endvolumen) 1× TE-Puffer und pipettieren Sie in das entsprechende Covaris-Röhrchen.
4. Stellen Sie Covaris auf das Programm für Fragmentgrößen von 300 bp ein.
5. Programm für jedes Rohr ausführen.
6. Führen Sie 5 oder 10 μl (ca. 400–500 ng) geschertem genomischem DNA und 10 μl DNA-Leiter auf einem 1,5%igen Agarosegel aus, um die Fragmentgröße zu überprüfen. Unsonizierte DNA (100–200 ng) kann auf demselben Gel als Vergleich verwendet werden.

Antikörperzugabe

1. Messen Sie das Volumen der sonizierten DNA nach dem Gel-Lauf und verdünnen Sie es mit 1× TE-Puffer auf 400 μl.
2. Wärme-Denaturierung im Trockenthermostat für 10 Minuten bei 95 °C und sofortige Kühlung auf Eis für 10 Minuten.
3. Halten Sie die Probe kühl und fügen Sie 100 μl kaltes 5× IP und 4–5 μg Antikörper (monoklonales Maus-Anti-5-Methylcytidin) zu der denaturierten, sonifizierten DNA hinzu. Inkubieren Sie die DNA-Antikörper-Mischung über Nacht auf einem Rotator bei 4 °C.

Perlen an DNA-Antikörper-Mischung binden

1. Vorwäsche der magnetischen Perlen (wir verwenden Dynabeads M-280 Schaf-Anti-Maus-IgG) wie folgt: Die Perlen gründlich durch Pipettieren auf und ab oder durch Drehen wieder in Suspension bringen. Sie müssen sich in einer homogenen Lösung befinden, und wenn mehrere Proben verarbeitet werden, müssen sie häufig wieder in Suspension gebracht werden, da sie schnell absinken.
2. Übertragen Sie das benötigte Gesamtvolumen (50 μl pro Probe) in ein Zentrifugenröhrchen, fügen Sie das gleiche Volumen Waschpuffer hinzu (mindestens 1 ml) und resuspendieren Sie.
3. Stellen Sie das Röhrchen für 1–2 Minuten in einen Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand.
4. Resuspendieren Sie die Perlen in 1 ml Waschpuffer und inkubieren Sie sie 1 Minute auf Eis. Stellen Sie das Röhrchen für 1–2 Minuten auf den Magneten und entsorgen Sie den Überstand.
5. Entfernen Sie das Röhrchen von dem magnetischen Ständer und resuspendieren Sie die gewaschenen Perlen in demselben Volumen von 1× IP-Puffer wie das ursprüngliche Volumen der Perlen.
6. Fügen Sie 50 μl der Perlen zu den 500 μl der DNA-Antikörper-Mischung aus Schritt 2 hinzu.
7. Inkubieren Sie 2 Stunden auf einer rotierenden Plattform bei 4 °C.

DNA-Antikörper-Perlenmischung Waschung

1. Nach der 2-stündigen Inkubation die Perlen dreimal mit 1× IP-Puffer waschen wie folgt: Stelle das Röhrchen für 1–2 Minuten in den Magnetständer und entsorge den Überstand. Entferne das Röhrchen aus dem Magnetständer. Füge 1 ml kalten 1× IP-Puffer hinzu. Mische durch Umkehren des Röhrchens oder sanftes Vortexen. Inkubiere das Röhrchen 1 Minute auf Eis. Stelle das Röhrchen für 1–2 Minuten in den Magnetständer und entsorge den Überstand. Wiederhole dies zweimal für insgesamt drei Wäschen.
2. Resuspendieren Sie die Perlen in 250 μl Verdauungs-Puffer.
3. Fügen Sie 3,5 μl Proteinase K (20 mg/ml) zu den resuspendierten Perlen hinzu.
4. Inkubieren Sie 2–3 Stunden auf einer rotierenden Plattform bei 55 °C.

DNA-Reinigung

1. Entfernen Sie das Parafilm und fügen Sie 250 μl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu jedem Röhrchen hinzu. Vortexen Sie 30 Sekunden und zentrifugieren Sie bei 14.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die wässrige Überstand und übertragen Sie sie in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie 250 μl Chloroform zu dem Überstand aus Schritt 1 hinzu. Vortexen Sie kurz und zentrifugieren Sie bei 14.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den wässrigen Überstand und übertragen Sie ihn in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
Fügen Sie 2 μl des Copräzipitants GlycoBlue (20 mg/ml, Life Technologies) hinzu und mischen Sie gut.
Fügen Sie 20 μl 5 M NaCl und dann 500 μl 100% Ethanol hinzu. Gut mischen.
5. Fällung bei −20 °C für 1 Stunde bis über Nacht.
6. Zentrifugieren Sie bei 14.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das blaue Pellet zu stören.
7. Waschen Sie einmal bis zweimal mit 1 ml 70% Ethanol, indem Sie bei −20 °C 10 Minuten inkubieren und dann erneut 10 Minuten zentrifugieren. Überstehende Flüssigkeit entsorgen. Dann erneut kurz zentrifugieren, um die restliche Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit mit einer Gel-Lade- oder einer anderen feinen Pipettenspitze.
8. Lassen Sie die Proben auf der Arbeitsfläche an der Luft trocknen.
9. In 25 μl nukleasefreies Wasser resuspendieren.
10. Messen Sie die DNA-Konzentration.

Bibliotheken für die Next-Generation-Sequenzierung

1. Da die durch MeDIP gewonnenen DNA-Fragmente einzelsträngig sind, muss der erste Schritt doppelsträngige DNA für die Bibliotheksvorbereitung erzeugen.
Verwenden Sie zwischen 10 und 1000 ng einzelsträngiger DNA-Fragmente und annealieren Sie 10 ng/μl zufällige Hexamer-Primer an die Probe, indem Sie sie in einem Thermocycler auf 95 °C erhitzen und dann sofort auf Eis abkühlen.
3. Führen Sie die Synthese des zweiten DNA-Strangs durch, was, wenn Sie das oben erwähnte NEB-Kit verwenden, Schritt 1.4 wäre.
4. Befolgen Sie den restlichen Protokoll des Herstellers, um Bibliotheken für die Next-Generation-Sequenzierung zu erhalten.
5. Bestimmen Sie den Bibliotheksausbeute mit Hilfe des Qubit High Sensitivity dsDNA Kits und führen Sie dann eine Qualitätskontrolle für die Fragmentgrößenbereiche und die Konzentration/Molarität durch.
6. Bibliotheken werden auf den Ihnen zur Verfügung stehenden Sequenziergeräten sequenziert, zum Beispiel Illumina HiSeq.

Referenz:

1. Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, et al. Genomweite Kartierung der DNA-Methylierung 5mC durch methylierte DNA-Immunpräzipitation (MeDIP)-Sequenzierung[J]. DNA-Modifikationen: Methoden und Protokolle, 2021: 301-310.