Protokoll zur Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken aus degradiertem DNA

Stumpf-endende DNA-Fragmente

1. Stellen Sie den Mastermix für die stumpfe Endreparatur zusammen. Enthalten pro Reaktion:
(a) 5,0 μL von 5× End Repair Puffer.
(b) 0,25 μL Blunt Ending Enzym.
Verteilen Sie 5,25 μL der Mischung in jedes beschriftete PCR-Röhrchen.
3. Fügen Sie in jedes einzelne PCR-Röhrchen 19,5 μL DNA-Extraktion hinzu (oder bringen Sie das Endvolumen auf 25 μL, indem Sie ddH hinzufügen).₂O, entsprechend dem ursprünglichen Volumen der Vorlage).
4. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei 20 °C in einem Thermocycler und inaktivieren Sie dann das Enzym durch Inkubation für 20 Minuten bei 72 °C.

Adapter-Ligation

1. Entfernen Sie das Rohr mit der stumpfen DNA aus dem Thermocycler und lagern Sie es auf Eis.
2. Bereiten Sie die Adapter-Ligationsreaktionsmischung vor, einschließlich pro Reaktion:
(a) 2,5 μL von 10× Ligase-Puffer.
(b) 1,0 μL des P1-Adapters.
(c) 0,5 μL dNTP-Mix.
(d) 0,5 μL DNA-Ligase.
(e) 2,0 μL Nick Repair Polymerase.
Verteilen Sie 6,5 μL der Mischung in ein neues PCR-Röhrchen.
Fügen Sie 1,0 μL von jedem der gewählten PGM-Barcodes X in das PCR-Röhrchen jeder entsprechenden Probe hinzu.
Fügen Sie 20,5 μL von blunt-ended DNA hinzu.
6. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten bei 25 °C in einem Thermocycler, gefolgt von 5 Minuten bei 72 °C.

Perlenreinigung

1. Bereiten Sie eine frische 70% Ethanol-Lösung mit einem Endvolumen von mindestens 500 μL mal Anzahl der Proben vor.
Fügen Sie 40 μL SPRIselect-Perlen zum Produkt aus Abschnitt 3.3 hinzu, um ein finales Verhältnis von 1,8× zu erreichen (was zu einer breiten Palette von zurückgewonnenen Fragmentgrößen und einer oberen Grenze von ca. 200 bp führen sollte).
3. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren und lassen Sie die Röhrchen 1 Minute im Magnetrack inkubieren.
4. Entfernen Sie den Überstand, ohne die magnetischen Perlen zu stören.
5. Fügen Sie 500 μL frisch zubereiteter 70%iger Ethanol zu jeder Probe hinzu, mischen Sie gut und lassen Sie die Röhrchen inkubieren, bis alle Perlen von der magnetischen Halterung erfasst sind.
6. Entfernen Sie den Überstand, ohne die magnetischen Perlen zu stören, und lassen Sie sie maximal 5 Minuten an der Luft trocknen.
Fügen Sie 20 μL ddH hinzu.₂Um die DNA zu eluieren, gut mischen und die Röhrchen für eine weitere Minute im Magnetständer ruhen lassen.
8. Entfernen Sie die Elution und übertragen Sie sie in ein neues (beschriftetes) Röhrchen, und lagern Sie es bis zur nächsten Reaktion auf Eis.

Verstärkung

1. Verdünnen Sie die Primer, indem Sie 10 μL der Primer-Stammlösung (bei 100 μM) in 90 μL ddH hinzufügen.₂O.
Verteilen Sie 15 μL in jedes PCR-Röhrchen und fügen Sie 5,0 μL des gereinigten Produkts hinzu.
3. In der modernen DNA, richten Sie das Labor ein und betreiben Sie den Thermocycler mit folgendem Protokoll: Denaturierung für 10 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 15 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 °C, 45 Sekunden bei 60 °C und 45 Sekunden bei 72 °C. Die finale Verlängerung erfolgt bei 72 °C für 5 Minuten.
4. Fassen Sie alle parallelen Amplifikationen für dasselbe Sample zusammen und eluieren Sie die Sequenzierungsbibliotheken in 20 μL.
5. Visualisieren Sie die Bibliothekskonzentration und die Verteilung der Fragmentgrößen.

Referenz:

1. Martins R F, Kampmann M L, Förster D W. Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken aus degradierten Proben für Nicht-Illumina-Sequenzierungsplattformen. Antike DNA: Methoden und Protokolle, 2019: 85-92.