Bibliotheksvorbereitung für das 16S rRNA Sequenzierungsprotokoll

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1. Bereiten Sie die Arbeitsstation PCR-Haube oder Biosicherheitskabine vor und reinigen Sie sie.
2. Auftauen und die Reagenzien auf Eis lagern, sanft vortexen und vor der Verwendung zentrifugieren.
Bereiten Sie die PCR-Reaktion in Dreifach-Ansätzen mit den folgenden Reagenzien in PCR-Röhrchen oder einer 96-Well-Platte vor. Nuclease-freies Wasser, 13,0 μL; PCR Master Mix, 10,0 μL; Vorwärtsprimer 515f (10 μM), 0,5 μL; Rückwärtsprimer 806r (10 μM), 0,5 μL; und Template-DNA, 1,0 μL.
3. Schalten Sie den Thermocycler im Voraus ein, damit das Gerät aufwärmen kann.
4. Vor dem Einlegen der Röhrchen oder Platten in den Thermocycler, zentrifugieren Sie diese 1 Minute lang bei 290 × g, um die Reagenzien am Boden des Röhrchens oder der Vertiefung zu sammeln.
5. Führen Sie die Röhrchen oder die Platte in den Thermocycler ein und stellen Sie die folgenden Zyklusbedingungen ein:
(a) 94 °C für 3 Minuten.
(b) 94 °C für 45 s.
(c) 50 °C für 60 s.
(d) 72 °C für 90 s.
(e) Wiederholen Sie die Schritte (a–d) 35 Mal für insgesamt 35 Zyklen.
(f) 72 °C für 10 Minuten.
Bei 4 °C lagern.
6. Nach Abschluss können die Proben sicher bei 4 °C oder − 20 °C gelagert werden. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen.
7. Nach der Amplifikation die dreifachen Proben in einem Gesamtvolumen von 75 μL zusammenfassen.

Agarose-Gelelektrophorese

1. Bereiten Sie 1,5% Agarose in 1× TAE-Puffer in einem Erlenmeyerkolben vor. Das Volumen variiert je nach Größe des Gelkastens.
2. Mikrowelle den Kolben, um das Agarosepulver aufzulösen, und lasse es etwa 15 Sekunden lang kochen. Stelle sicher, dass die Lösung visuell klar ist.
3. Geben Sie die entsprechende Menge SYBR Safe DNA-Gel-Färbung (5 μL/50 mL) in den Erlenmeyerkolben und schwenken Sie vorsichtig, um zu mischen.
4. Gießen Sie die Mischung langsam in die Gelform, verwenden Sie eine Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen.
5. Setzen Sie einen Kamm der geeigneten Breite in das Gel, verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eventuelle Blasen zu entfernen, und lassen Sie das Gel etwa 25 Minuten ruhen, um zu festigen.
6. Sobald das Gel vollständig erstarrt ist, entfernen Sie vorsichtig den Kamm, indem Sie ihn gerade nach oben heben. Beschädigen Sie die Wells nicht beim Entfernen des Kamms.
7. Setzen Sie die Gelwanne in die Gelbox. (Überprüfen Sie die Ausrichtung der Pufferkammer; das Gel sollte von den schwarzen zu den roten Elektroden laufen.)
8. Fügen Sie 1× TAE-Puffer hinzu, um das Gel gerade so zu bedecken, dass die Wells vollständig abgedeckt sind.
9. Mischen Sie jede Probe mit Ladefarbstoff (z.B. 6× Ladefarbstoff: 1 μL Ladefarbstoff + 5 μL PCR-Produkt).
10. Laden Sie die DNA-Leiter und die Proben in die Vertiefungen des Gels.
11. Nachdem Sie die Proben einschließlich der No-Template-Kontrolle (NTC) in die verschiedenen Wells des Gels geladen haben, setzen Sie den Deckel auf die Pufferkammer und stecken Sie die Kabel in die Elektrophoresekiste.
12. Schalten Sie die Elektrophoresebox ein und stellen Sie die geeignete Spannung und Laufzeit ein; stellen Sie die Spannung auf Volt ein.
13. Wenn das Gel fertig gelaufen ist, nehmen Sie die Gelwanne aus der Pufferkammer und schieben Sie vorsichtig einen UV-Transilluminator oder ein Imager zur Visualisierung des Gels und des erwarteten Bands des Amplicons hinein.

Quantifizierung und Normalisierung

1. Quantifizieren Sie die PCR-Amplicons mit einem DNA-Quantifizierungs-Kit. Wir verwendeten das Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Nach der Quantifizierung jedes Probenpools gleichwertige Mengen von 240 ng Amplikon aus jeder Probe in ein steriles Röhrchen oder Röhrchen abfüllen.

Reinigung des PCR-Produkts

1. Verwenden Sie ein PCR-Reinigungskit für die gepoolten PCR-Produkte. Das QIAquick PCR-Reinigungskit wird gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
2. Die eluierten, gereinigten Poolbibliotheken sollten bereit zur Einreichung bei einer Sequenzierungsstelle sein. Die beste Qualitätssicherung und Qualitätskontrolle (QA/QC) besteht darin, die gesamte Bibliothek durch quantitative PCR (qPCR) zu quantifizieren.

qPCR

1. Verwenden Sie das KAPA Library Quantification Kit für Illumina-Plattformen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Sobald die Bibliothek durch qPCR genau quantifiziert wurde, sollte sie bereit für die Sequenzierung sein.
Diese Bibliothek sollte in einem Illumina MiSeq-Sequenzer mit einer 2 × 250 Paar-End-Chemie betrieben werden.

Referenz:

1. Maldonado J, Yaron J R, Zhang L, et al. Vorbereitung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken für die 16S rRNA-Mikrobiomanalyse nach Serpin-Behandlung[J]. Serpins: Methoden und Protokolle, 2018: 213-221.