Identifizierung von m6A-RNA-Modifikationen durch Nanopore-Sequenzierungsprotokoll

Direkte RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung

Vorbereitung der Eingangs-RNA

1. Poolen Sie jeden Curlcake (für unmodifizierte und m6A-modifizierte separat) in ein DNA LoBind-Röhrchen, das 200 ng von jedem enthalten wird (insgesamt 800 ng).
2. Stellen Sie das Volumen auf 9 μL mit nukleasefreiem Wasser ein und mischen Sie gründlich durch Inversion.
3. Kurze Zentrifugation in einem Mikrozentrifugen.
Adapter-Ligation
Mischen Sie in einem 0,2 mL dünnwandigen PCR-Röhrchen die Reagenzien aus dem Direct RNA Sequencing Kit.
2. Mischen durch Pipettieren und zentrifugieren.
3. Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit fahren Sie mit dem Schritt der reversen Transkription fort.

Rücktranskription und Bereinigung

1. Mischen Sie die Reagenzien, um die Mastermix für die umgekehrte Transkription herzustellen.
2. Fügen Sie das Master-Mix zu dem 0,2 mL PCR-Röhrchen hinzu, das die mit dem RT-Adapter ligierte RNA aus dem oben genannten Schritt "RT-Adapter-Ligation" enthält. Mischen Sie durch Pipettieren.
Fügen Sie 2 μl SuperScript III Reverse Transkriptase zur Reaktion hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
4. Platzieren Sie das Röhrchen in einem Thermocycler, inkubieren Sie es bei 50 °C für 50 Minuten und bei 70 °C für 10 Minuten, und bringen Sie die Probe anschließend auf 4 °C, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Übertragen Sie die Probe in ein 1,5 mL DNA LoBind Eppendorf-Röhrchen.
6. Resuspendieren Sie den Vorrat an Agencourt RNAClean XP-Perlen durch Vortexen, fügen Sie 72 μL Perlen zur reversen Transkriptionsreaktion hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
7. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Hula-Mixer.
Bereiten Sie 200 μL frisches 70% Ethanol in nukleasefreiem Wasser vor.
9. Zentrifugieren Sie die Probe und pelottieren Sie sie auf einem Magneten.
10. Halten Sie das Röhrchen am Magneten und waschen Sie die Perlen mit 150 μL 70% Ethanol, ohne das Pellet zu stören.
11. Entfernen Sie den Ethanol und entsorgen Sie ihn. Zentrifugieren Sie die Röhrchen, stellen Sie sie zurück auf das Magnetrack und entfernen Sie jeglichen verbleibenden Ethanol.
12. Entfernen Sie das Röhrchen von der magnetischen Halterung und resuspendieren Sie das Pellet in 20 μL nucleasefreiem Wasser. Inkubieren Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Pelletieren Sie die Perlen auf dem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist.
Pipettiere 20 μL des Eluates in ein sauberes 1,5 mL Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen.
15. Messen Sie cDNA und RNA mit einem Qubit oder einem ähnlichen Gerät.

RMX-Adapter-Ligation und Aufräumarbeiten

1. In einem sauberen 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen die Reagenzien mischen.
2. Mischen Sie durch Pipettieren und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Resuspendieren Sie den Vorrat an Agencourt RNAClean XP-Perlen durch Vortexen, fügen Sie 40 μL Perlen zur Adapter-Ligation-Reaktion hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
4. Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Hula-Mixer.
5. Zentrifugieren Sie die Probe und pelleted sie auf einem Magneten. Lassen Sie das Röhrchen auf dem Magneten und pipettieren Sie die Überstände ab.
6. Fügen Sie 150 μL des Waschpuffers (WSB), der im Direct RNA Sequencing Kit enthalten ist, zu den Perlen hinzu. Resuspendieren Sie die Perlen, indem Sie das Röhrchen schütteln. Stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell, lassen Sie die Perlen sedimentieren und pipettieren Sie die Überstände ab. Wiederholen Sie den Vorgang. Lassen Sie die Perlen 2 Minuten an der Luft trocknen.
7. Entfernen Sie das Röhrchen von der magnetischen Halterung und resuspendieren Sie das Pellet in 21 μl Elutionspuffer. Inkubieren Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Pelletieren Sie die Perlen auf dem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist.
9. Entfernen Sie 21 μL des Eluats und behalten Sie es in einem klaren 1,5 mL Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen.
10. Messen Sie cDNA und RNA mit Qubit oder ähnlichem.
Mische die Bibliothek mit 17,5 μl Wasser.
12. Fügen Sie 37,5 μL RRB-Puffer hinzu (mischen Sie RRB vor der Verwendung durch Vortexen) und mischen Sie gut. Die Bibliothek ist jetzt bereit, in die Flusszelle geladen zu werden.

Referenz:

1. Liu H, Begik O, Novoa E M. EpiNano: Nachweis von m6A RNA-Modifikationen mittels Oxford Nanopore Direct RNA Sequencing[M]//RNA-Modifikationen. Humana, New York, NY, 2021: 31-52.