Ein Leitfaden zur DNA-Methylierungssequenzierung auf Einzelzellebene: Von der nassen Experimentierung bis zur Datenanalyse

Was ist die DNA-Methylierung auf Einzelzellebene?

DNA-Methylierung ist ein epigenetisches Merkmal, das während der Zellteilung vererbt wird und die biologische Funktion von Zellen beeinflusst. Unterschiede zwischen Zellen können mit Unterschieden in epigenetischen Markern korrespondieren, die wiederum mit der Genexpression in Zusammenhang stehen. Eine genomweite Methylierungsanalyse auf Einzelzellebene wird Einblicke in die transkriptionale Regulation und zelluläre Heterogenität bieten. Die Erforschung epigenetischer Unterschiede zwischen Zellen ist entscheidend für das Verständnis der Gewebeheterogenität. Jüngste Fortschritte in der Methylierungsabbildung von Einzelzellen bieten die Möglichkeit, eine solche Heterogenität zu entdecken.

Wie man die DNA-Methylierungsprofilierung auf Einzelzellebene durchführt?

Bisulfit-Konversionsmethodik

Die Bisulfit-Konversionsmethode gilt als der Goldstandard für die DNA-Methylierungsanalyse. Sie wird von Forschern aufgrund ihrer hohen Konversionsrate (>99%), Reproduzierbarkeit und der einfachen Handhabung über kommerzielle Kits bevorzugt.

Die Hauptunterschiede zwischen RRBS und WGBS

RRBS und WGBS sind beliebte Methoden zur genomweiten Methylierungsanalyse. Beide Methoden umfassen die Bisulfit-Konversion und die NGS-Vorbereitung. Der Hauptunterschied besteht darin, dass RRBS geeignete Restriktionsendonukleasen und Größenselektion verwendet, um GC-reiche Regionen zu filtern. GBS (insbesondere MethylC-seq) hat den Vorteil, dass es die meisten CpGs im Genom abdecken kann. Der Reinigungs- und Screening-Prozess ist im Vergleich zu RRBS relativ einfach mit WGBS. Die Verhinderung von Abbauverlusten während der Bisulfit-Transformation in WGBS wird als relativ wichtig erachtet, und daher basieren viele Einzelzellmethoden, die auf WGBS basieren, oft auf PBAT.

scRRBS und scWGBS (Ahn J et al., 2021)

Der Arbeitsablauf von Single-Cell RRBS

Konventionelles RRBS kann in fünf Schritte unterteilt werden. Der erste Schritt ist die Verdauung von DNA mit Restriktionsendonukleasen, der zweite Schritt ist die Splice-Ligation und deren Vorbehandlung, der dritte Schritt ist die Auswahl von GC-reichen Stellen, der vierte Schritt ist die Bisulfid-Transformation und schließlich der Amplifikationsprozess vor der Sequenzierung. Diese Prozesse beinhalten mehrere Reinigungsschritte, mit einem abschließenden Amplifikationsschritt, der darauf ausgelegt ist, Verluste in den vorherigen Prozessen auszugleichen. Im Gegensatz zum konventionellen RRBS garantiert das Einzelzell-RRBS nicht, dass die Ziel-DNA während des finalen Amplifikationsprozesses intakt bleibt, aufgrund der geringen DNA-Menge, die von einer einzelnen Zelle durch konventionelle Methoden eingegeben wird. Daher wird das Einzelzell-RRBS in Bezug auf die Verlustreduzierung verfeinert. scRRBS ist eine Methode, die sich darauf konzentriert, die Verluste zu minimieren, die während des Reinigungsprozesses auftreten. Die Verlustreduzierung wird durch den Verdau von Restriktionsendonukleasen, den Splice-Ligation-Prozess und die Transformation von Bisulfiten in einem einzigen Röhrchen ohne Reinigung erreicht.

Der Workflow der Einzelzell-WGAS

WGBS ist die vollständige Genom-Methylierungssequenzierung und bietet eine umfassendere genomische Abdeckung als die RRBS-Methode, die nur CpG-Inseln abdeckt. WGBS ist einfacher als RRBS, da es keine Enzymverdauung, Größenauswahl und Schritte zur Zerkleinerung und Reinigung der Proben erfordert. Der Verlust von Proben bei WGBS ist jedoch hauptsächlich auf die Bisulfit-Konversion zurückzuführen. Es kann auch durch die PBAT-Methode optimiert werden.

(a) Übersicht über die Post-Bisulfite-Adaptor-Tagging (PBAT)-Methode zur Vermeidung von Verlusten aufgrund von Abbau während des Bisulfite-Konversionsprozesses. (b) Übersicht über die Einzelröhrenreaktion. (Ahn J et al., 2021)

BS konversionsfreie Methodik

Methoden zur Methylierungssequenzierung ohne BS-Konversion fallen in zwei Hauptkategorien: solche, die die Affinitätsbindung von Methylcytosin ausnutzen, und solche, die die Sensitivität von Restriktionsendonukleasen gegenüber Methylcytosin nutzen. MBD-seq und MeDIP-seq sind repräsentative Methoden mit affinitätsbasierten Profilen. Affinitätsbasierte Methoden sind für die Anwendung bei Einzelzellsequenzierungen nicht geeignet, da sie auf DNA-Fragmenten basieren, um ein durchschnittliches DNA-Methylierungsprofil zu erzeugen, und daher Unterschiede in den DNA-Methylierungsmustern in einzelnen Zellen nicht unterscheiden können. Im Gegensatz zu affinitätsbasierten Methoden wurden jedoch MSRE-basierte Methoden für die Verwendung in der Einzelzellsequenzierung verfeinert, und scCGI-seq misst die Methylierung auf ähnliche Weise wie Methyl-seq.

Derzeit bleibt das Bisulfit-Konversionsverfahren eine der häufigsten Methyliertests. Daher verwendet die nächste Präsentation über analytische Methoden das Bisulfit-Konversionsverfahren als Beispiel.

Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierungsdatenanalyse

Analyseverfahren der DNA-Methylierung. (Ahn J et al., 2021)

Datenqualitätsbewertung

Nach der Durchführung von Sequenzierungsexperimenten, einschließlich RRBS und WGBS, muss die Sequenzdaten vorverarbeitet werden. Die Schritte zur Vorverarbeitung lassen sich in Datenqualitätskontrolle (QC), Trimmen der Sequenzierungsreads und den Vergleich der Sequenzierungsreads unterteilen. Der erste Teil der QC misst die allgemeine grundlegende Qualität der Sequenzierungsdaten mithilfe von Softwareprogrammen wie FastQC. Nach einer gründlichen Bewertung der Sequenzqualität sollte die Umwandlungseffizienz der Bisulfit-Sequenzierung bestimmt werden. Bei Proben mit niedrigen Umwandlungsraten von schwerem Bisulfit ist es schwierig, zwischen Basen zu unterscheiden, die als Cytosine am CpG-Stelle sequenziert wurden, und echten methylierten Cytosinen oder Sequenzierungsfehlern. Dies spielt eine Rolle als Störfaktor in der nachgelagerten Analyse, einschließlich der Identifizierung unterschiedlich methylierten Regionen. Die Umwandlungseffizienz kann direkt aus der hinzugefügten unmethylierten Lambda-DNA gewonnen werden, indem der Anteil der umgewandelten Basen an der Cytosinposition berechnet oder verfügbare Softwareprogramme verwendet werden.

Sequenzbeschneidung und -vergleich

Die Sequenzbeschneidung erfolgt mit der Software, und die beschnittenen Sequenzreads werden dann mit dem Referenzgenom verglichen, was es ermöglicht, niedrigqualitative oder mehrdeutige Basenaufrufe sowie Adaptersequenzen, die während der Bibliotheksvorbereitung eingeführt worden sein könnten, zu erkennen und zu entfernen.

Methylierungsanalyse unter Verwendung des Methylierungsniveaus

Das Hauptziel der Methylierungsanalyse besteht darin, epigenetische Beweise für Unterschiede zwischen den einzelnen Proben, Organen und Krankheitszuständen (einschließlich Krebs) zu erforschen. Um diese Unterschiede zu entdecken, ist ein numerischer Wert erforderlich, der dieses Konzept charakterisiert, üblicherweise ein Beta-Wert, der mit der untenstehenden Formel berechnet wird. Nach dem Methylierungsaufruf werden anschließende Analysen wie die visuelle Analyse von t-SNE, Clusteranalysen und die Identifizierung von unterschiedlich methylierte Cytosinen (DMCs) oder unterschiedlich methylierte Regionen (DMRs) durchgeführt.

Methylierungsanalyse unter Verwendung von Lese-Methylierungsmustern

Jüngste Methylierungsanalysen haben die Methylierungsmuster jedes Reads genutzt, um Krankheiten, insbesondere Krebs, zu diagnostizieren. Dieses neue analytische Konzept basiert auf der biologischen Eigenschaft der Methylierung, d.h. der Tendenz, die Methylierung zwischen benachbarten CpG-Stellen aufrechtzuerhalten, es sei denn, es tritt eine ab initio Methylierung auf. Diese Methode der Analyse von Reads-Mustern ist in der Lage, DNA-Moleküle mit Krankheitssignalen zu erkennen und hat das Potenzial, die Chancen auf die Erkennung von Krankheitssignalen zu erhöhen. Zum Beispiel hat eine große Studie zur Flüssigbiopsie einen integrierten Klassifikator entwickelt, um Tumortypen basierend auf der Analyse von Reads-Mustern zu klassifizieren, und zeigte signifikante Ergebnisse bei der Erkennung von Frühstadien von Krebs. Darüber hinaus ist die Quantifizierung von tumorabgeleiteten DNA-Molekülen durch Methylierungsmuster eine weitere Möglichkeit, die Tumorlast zu betrachten.

Methylierungsanalyse unter Verwendung von Lese-Methylierungsmustern. (Ahn J et al., 2021)

Anwendungen der Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung

Forschung zur Zellentwicklung

Die Reifung von Keimzellen oder embryonalen Zellen wird durch die Expression spezifischer Gene beeinflusst, die mit dem Methylierungsgrad in der DNA korrelieren. Basierend auf dem Methylierungsprofil von prä-implantatorischen embryonalen Zellen wurden beispielsweise die Mechanismen der Methylierung prä-implantatorischer Zellen und deren Phänomene untersucht, indem man die Methylierung von Einzelzellen durch das Verfolgen früher embryonaler Linien sequenzierte. Das Team stellte fest, dass die Nicht-CpG-Methylierung während der Oocytenreifung zunimmt, was auf eine andere Rolle der Nicht-CpG-Methylierung im Vergleich zur CpG-Methylierung während der Oocytenreifung hindeutet.

Krankheitsbezogene Forschung

Bei Patienten mit der Krankheit unterscheidet sich das Muster der DNA-Methylierung von dem gesunder Individuen. Unter den verschiedenen Krankheiten weist insbesondere Krebs ein DNA-Methylierungsmuster auf, das normale Zellen nicht haben, was zu Unterschieden in den Genexpressionsniveaus führt. Bei der Untersuchung von Krebserkrankungen mit dieser Heterogenität muss ein Multi-Omics-Ansatz verwendet werden, der genomische Variationen und RNA-Expression zur Analyse kombiniert. Beispielsweise hat eine Forschungsgruppe kürzlich eine Methode namens scTrio-seq2 entwickelt, die Daten aus der Einzelzell-Transkriptom- und Einzelzell-Methylierungssequenzierung integriert. Mehrere Studien haben gezeigt, dass ein Multi-Omics-Ansatz unter Verwendung von Einzelzell-Methylierungssequenzierung (sc-methyl-seq) die Einschränkungen früherer Methoden überwinden und eine bessere Differenzierung ermöglichen kann. Somit kann sc-methyl-seq in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden, um grundlegende Fragen zu biologischen Prozessen und Krankheiten zu beantworten.

Referenz

1. Ahn J, Heo S, Lee J, et al. Einführung in Methoden zur Einzelzell-DNA-Methylierungsprofilierung[J]. Biomoleküle, 2021, 11(7): 1013.