Vollständiges HLA-Typisierungsverfahren unter Verwendung des PacBio SMRT-Sequenzierungsprotokolls

HLA-Amplicon-Generierung

DNA-Extraktion

Pipettiere 20 μl Proteinase K in den Boden eines 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens.
2. Fügen Sie 200 μl Blutprobe gefolgt von 200 μl Puffer AL in das Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Mischen Sie die Probe durch Puls-Vortexing für 15 s.
3. Inkubieren Sie bei 56 °C für 10 Minuten.
4. Zentrifugieren Sie den Inhalt und fügen Sie 200 μl Ethanol (96-100%) zur Probe hinzu.
5. Mischen Sie erneut durch 15 Sekunden Puls-Vortexen, gefolgt von Zentrifugieren, um Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen.
6. Zentrifugieren Sie bei 6000 × g (8000 U/min) für 1 Minute.
7. Entsorgen Sie das Sammlungsglas mit dem Filtrat und legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Sammlungsglas.
8. Fügen Sie 500 μl Puffer AW1 hinzu, ohne den Rand zu benetzen, und zentrifugieren Sie bei 6000 × g (8000 U/min) für 1 Minute.
9. Platzieren Sie die Spin-Säule in einem anderen sauberen 2 ml Sammlungstube und entsorgen Sie das Sammlungstube, das das Filtrat enthält.
10. Fügen Sie 500 μl Puffer AW2 zur Säule hinzu, ohne den Rand zu benetzen. Schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g; 14.000 U/min) für 3 Minuten.
11. Legen Sie die Spin-Säule erneut in ein neues 2 ml Sammlungsglas und entsorgen Sie das alte Sammlungsglas mit dem Filtrat.
Zentrifugieren Sie die Säule 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit.
13. Stellen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Auffangröhrchen mit dem Filtrat.
14. Fügen Sie 200 μl Puffer AE oder destilliertes Wasser hinzu. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (15-25 °C) für 1 Minute und zentrifugieren Sie dann bei 6000 × g (8000 U/min) für 1 Minute.

Bewertung der DNA-Qualität und -Quantität

1. Analysieren Sie die Qualität von DNA auf einem 1% w/v Agarosegel unter Verwendung von 3 μl extrahierter DNA.
2. Quantifizieren Sie die DNA mit 1 μl DNA und analysieren Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers.

PCR-Amplifikation von Voll-Längen HLA-Genen

Alle Reaktionen müssen auf Eis durchgeführt werden.
2. Tauchen Sie 10× Long Range PCR-Puffer, dNTP-Mischung, nukleasefreies H₂O und Primerlösungen. Mischen Sie die Lösungen gründlich und zentrifugieren Sie sie kurz vor der Verwendung.
3. Bereiten Sie eine Reaktionsmischung vor. Bereiten Sie eine separate Reaktionsmischung für jeden Amplifikationsprimer vor.
4. HLA-DQB1 erfordert die Zugabe von Q-Lösung und die doppelte Menge an Long-Range-Enzym pro Reaktion.
5. Vortexen Sie die Reaktionsmischung gründlich und zentrifugieren Sie kurz.
6. Fügen Sie das Reaktionsgemisch in jedes PCR-Röhrchen hinzu. Das geeignete Volumen beträgt 25 μl minus die Menge an DNA, die im nächsten Schritt hinzugefügt wird.
7. Fügen Sie 1-4 μl Template-DNA (50-200 ng) zu jedem Röhrchen mit der Reaktionsmischung hinzu.
8. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß den Anweisungen des Herstellers.
9. Nach der Amplifikation die Proben über Nacht bei 2-8 °C lagern.

Qualitätsbewertung von PCR-Ampliconen

1. Quantifizieren Sie die Amplicons der Gene der Klassen I und II mit 1 μl des PCR-Assays und analysieren Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers.
2. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1% w/v Agarosegel unter Verwendung von 3 μl jeder PCR-Prüfung.
3. Bestätigen Sie die Größe des Amplicons durch PCR.

PCR-Produktreinigung

Alle Amplicons der Klasse I und II Gene wurden mit einem Kit gereinigt.
2. Lassen Sie die AMPure-Perlen eine halbe Stunde bei Raumtemperatur stehen.
3. Fügen Sie 0,6× AMPure-Perlen hinzu (z. B. für 100 μl fügen Sie 60 μl AMPure-Perlen hinzu) zum PCR-Amplifikat und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab.
4. Drehen Sie das Röhrchen, um die Perlen zu sammeln, und lassen Sie es 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
5. Halten Sie das Röhrchen in einem magnetischen Perlenständer, bis die Perlen an die Seite des Röhrchens gesammelt sind und die Lösung klar erscheint.
6. Lassen Sie die Röhrchen auf dem magnetischen Perlenständer und entfernen Sie das klare Überstand in ein anderes Röhrchen, indem Sie es abpipettieren.
7. Entfernen Sie das Röhrchen nicht von dem magnetischen Perlenständer und fügen Sie frisch zubereitetes 70% Ethanol auf die gegenüberliegende Seite der Perlen in das Eppendorf-Röhrchen hinzu.
8. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen von 70% Ethanol, um das Röhrchen zu füllen, ohne die Perlen zu stören. Lassen Sie das Röhrchen 30 Sekunden stehen.
9. Nach 30 Sekunden pipettieren und die 70% Ethanol entsorgen.
10. Wiederholen Sie die Schritte 6-8 oben.
11. Entfernen Sie den verbleibenden 70% Ethanol durch einen kurzen Spin und stellen Sie es wieder auf den Magnetständer.
12. Pipettieren Sie den verbleibenden 70% Ethanol ab.
13. Lassen Sie die Perlen 30-60 Sekunden an der Luft trocknen (mit geöffneten Röhrchenverschlüssen).
14. Entfernen Sie das Röhrchen von der magnetischen Halterung und fügen Sie 50 μl Elutionspuffer zur Probe hinzu. Eluieren Sie die DNA von den Perlen.
15. Vortexen Sie 30 Sekunden lang und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
16. Setzen Sie das Röhrchen zurück auf das magnetische Gestell, um die Probe von den Perlen zu eluieren, und übertragen Sie die Probe in ein frisches Röhrchen.

Qualitätsbewertung von gereinigten PCR-Amplifikaten

1. Quantifizieren Sie die gereinigten Amplicons der Klasse I und II Gene mit 1 μl DNA und analysieren Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers.
2. Überprüfen Sie die Größe des Amplicons und der Reagenzien gemäß dem Protokoll des Herstellers.
3. Bestätigen Sie die Größe der Amplicons gemäß der erwarteten Größe.

HLA SMRTbell Bibliotheksvorbereitung

1. Bereiten Sie die SMRTbell-Bibliothek mit dem SMRT-Vorlagenvorbereitungs-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers vor. Das Protokoll zur Vorbereitung der SMRT-Vorlage besteht aus den folgenden Schritten.
2. Äquimolare Pooling von gereinigtem PCR-Amplicon.
3. Repariere DNA-Schäden.
4. Reinigen Sie die reparierte DNA.
5. Stumpf-Ende-Ligation von SMRTbell-Adaptern an die end-reparierten Amplicons.
6. Fügen Sie Exonuklease hinzu und inkubieren Sie.
7. Reinigen Sie die SMRTbell-Vorlagen.
8. SMRTbell Bibliotheksqualitätsbewertung.
9. Primer an SMRTbell-Vorlagen anlagern.
10. Binden Sie die Polymerase an SMRTbell-Vorlagen.

Äquimolare Pooling von gereinigtem PCR-Amplicon

1. Poolen Sie die gleichmäßige molare Konzentration von HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 und HLA-DRB1 als eine Probe.
2. Halten Sie das Zielvolumen des finalen Pools (μl) bei 20 μl und die Zielkonzentration pro Amplicon (nM) für den äquimolaren Pool bei 4 nM.

Reparatur von DNA-Schäden in Ampliconen

1. Tauchen Sie die Kit-Komponente auf Eis und fügen Sie die Reagenzien in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
2. Mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren und zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens.
3. Inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten oder länger, und bringen Sie die Reaktion dann für 1 Minute auf 4 °C zurück.

Reinigen Sie die reparierte DNA

1. Bringen Sie das Perlenreagenz auf Raumtemperatur und mischen Sie es gut, bis die Lösung homogen erscheint.
2. Fügen Sie 0,6× Volumen von AMPure PB-Magnetperlen zur End-Reparaturreaktion hinzu und mischen Sie durch Pipettieren auf und ab.
3. Drehen (oder pulsieren) Sie das Röhrchen, um die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie das Röhrchen auf einen Vortex-Mischer.
4. Lassen Sie die DNA durch Schütteln bei 2000 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur an den Perlen binden, bis die Perlen/DNA-Mischung homogen erscheint.
Drehen Sie das Röhrchen für ein paar Sekunden, um die Perlen zu sammeln.
6. Stellen Sie das Röhrchen in einen magnetischen Perlenständer, bis sich die Perlen an der Seite des Röhrchens sammeln und die Lösung klar erscheint.
7. Lassen Sie die Röhrchen auf dem magnetischen Perlenrack, und entfernen Sie das klare Überstand in ein anderes Röhrchen, indem Sie es abpipettieren.
8. Entfernen Sie das Röhrchen nicht von dem magnetischen Perlenständer und fügen Sie frisch zubereitetes 70% Ethanol auf die gegenüberliegende Seite der Perlen in das Eppendorf-Röhrchen hinzu.
9. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen von 70% Ethanol, um das Rohr zu füllen, ohne die Perlen zu stören. Lassen Sie das Rohr 30 Sekunden stehen.
10. Nach 30 Sekunden pipettieren und die 70% Ethanol entsorgen.
11. Wiederholen Sie die Schritte 6-8 oben.
12. Entfernen Sie den verbleibenden 70% Ethanol durch einen kurzen Spin und stellen Sie es zurück auf das magnetische Stativ.
Pipettieren Sie den verbleibenden 70% Ethanol ab.
14. Lassen Sie die Perlen 30-60 Sekunden an der Luft trocknen (mit offenen Röhrchenkappen).
15. Entfernen Sie das Röhrchen von dem Magnetrack und fügen Sie 34 μl Elutionspuffer zur Probe hinzu. Eluieren Sie die DNA von den Perlen.
16. Vortex für 10 Minuten bei 2000 U/min.
17. Setzen Sie das Röhrchen zurück auf das magnetische Gestell, um die Probe von den Perlen zu eluieren, und übertragen Sie die Probe in ein frisches Röhrchen.
18. Die reparierte DNA kann über Nacht bei 4 °C oder für längere Zeit bei −20 °C gelagert werden.

Stumpf-End-Ligation von SMRTbell-Adaptern an die end-reparierten Amplicons

1. Auftauen Sie die Reagenzien auf Eis und mischen Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Fügen Sie den Adapter zur DNA hinzu, während alle anderen Komponenten zum Master Mix hinzugefügt werden sollten. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit Wasser auf 40 μl ein.
3. Mischen Sie die Reaktion gut, indem Sie pipettieren, und zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens.
4. Bei 25 °C 15 Minuten inkubieren.
5. Inkubieren Sie bei 65 °C für 10 Minuten, um die Ligase zu inaktivieren, und lagern Sie bei 4 °C.
6. Stoppen Sie nicht und fahren Sie fort, Exonuklease nach diesem Schritt hinzuzufügen.

Fügen Sie Exonuklease hinzu und inkubieren Sie.

1. Tauchen Sie das Reagenz auf Eis und mischen Sie die Reaktion gut durch Pipettieren.
2. Zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens kurz in einer Mikrozentrifuge.
3. Fügen Sie die Reagenzien gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und zentrifugieren Sie.
4. Inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde, und bringen Sie dann die Reaktion zurück auf 4 °C.

SMRTbell-Bibliotheksqualitätsbewertung

1. Quantifizieren Sie die Bibliotheken mit 1 μl DNA gemäß dem Protokoll des Herstellers.
2. Überprüfen Sie die Größe der Bibliothek.

Primers an SMRTbell-Vorlagen anbringen

1. Klicken Sie im Rechner auf die Option Anzahl der SMRT-Zellen, die angibt, wie viele SMRT-Zellen vorbereitet werden sollen, und der Rechner bestimmt die erforderliche Menge an Probe.
2. Fügen Sie die Bibliothekskonzentration und die Größe der Bibliotheken hinzu.
3. Protokoll: Wählen Sie die Lade-Methode als MagBead.
4. Bindungs-Kit: Wählen Sie die Sequenzierungs-Polymerase als P6v2 aus.
5. Vorbereitungsprotokoll: Kleiner Maßstab.
6. Langzeitlagerung: Nein.
7. DNA-Kontrollkomplex: Ja.
8. Komplexe Wiederverwendung: Nein.
9. Standardkonzentration: Ja
10. Klicken Sie auf den Abschnitt Benutzerdefinierte Parameter.
11. Konzentration auf der Platte: Verwenden Sie die Standardempfehlung von 0,01 nM.
12. Verhältnis des DNA-Kontrollkomplexes zur Vorlage: Verwenden Sie die Standardempfehlung von 1,2 %.
13. Polymerase: Template-Verhältnis: Verwenden Sie die Standardempfehlung von 10:1.
14. Primer: Vorlagenverhältnis: Verwenden Sie die Standardempfehlung von 20:1.
Für das Conditioning-Primärgerät:
(a) Verdünnen Sie den Sequenzierungsprimer von 5000 auf 150 nM in Elutionspuffer.
(b) Inkubieren Sie die verdünnten Primer bei 80 °C für 2 Minuten und halten Sie sie dann bei 4 °C.
Für den Annealing-Primer:
(a) Fügen Sie in ein frisches Röhrchen die entsprechende Menge an Reagenzien hinzu.
(b) Mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie bei 20 °C für 30 Minuten.
(c) Übertragen Sie an einen Ort bei 4 °C zur sofortigen Verwendung oder lagern Sie bei −20 °C.

Binden Sie Polymerase an SMRTbell-Vorlagen.

1. Tauchen Sie die Reagenzien für die Polymeraseverdünnung auf und bereiten Sie die Reaktion auf Eis vor.
2. Verdünnen Sie die Polymerase in einem 0,5 ml Röhrchen, mischen Sie durch Pipettieren und zentrifugieren Sie kurz.
3. Für die Bindung der Polymerase die Komponenten hinzufügen, durch Pipettieren mischen und kurz zentrifugieren.
4. Inkubieren Sie bei 30 °C für 30 Minuten und lagern Sie bei 4 °C.

Binden Sie den DNA-Komplex an MagBead.

1. Verdünnen Sie den DNA-Internal-Control-Komplex.
2. Verdünnen Sie die erste Verdünnung der DNA-Kontrolle weiter.
3. Verdünnen Sie das Probenkomplex.
4. Halten Sie die magnetischen Perlen kühl.
5. Fügen Sie 73,9 μl MagBeads zu einem leeren Röhrchen hinzu und stellen Sie es auf den Magnetständer.
6. Perlen sammeln. Die Überstände entfernen und entsorgen.
Fügen Sie 73,9 μl MagBead-Waschpuffer hinzu und waschen Sie, indem Sie langsam zehnmal ansaugen und abgeben.
8. Perlen sammeln. Überstand entfernen und entsorgen.
Fügen Sie 73,9 μl MagBead Binding Buffer hinzu und mischen Sie, indem Sie langsam zehnmal ansaugen und abgeben.
Fügen Sie 73,9 μl gewaschene Perlen zu einem neuen Röhrchen hinzu und stellen Sie es auf einen Magnetständer.
11. Perlen sammeln. Überstand entfernen und entsorgen.
Fügen Sie 19 μl des verdünnten Probenkomplexes hinzu und mischen Sie, indem Sie langsam zehnmal aspirieren und dispensieren.
13. Inkubieren Sie in einem Rotator bei 4 °C für 20 Minuten (bis zu 2 Stunden).
14. Halten Sie das Röhrchen mit dem MagBead-Komplex auf einer magnetischen Platte.
15. Perlen sammeln. Klare Überstände entfernen und entsorgen.
16. Fügen Sie 19 μl MagBead-Bindepuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie langsam zehnmal ansaugen und wieder abgeben.
17. Sammeln Sie die Perlen, indem Sie das Röhrchen auf den Magnetständer stellen. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.
18. Fügen Sie 19 μl MagBead-Waschpuffer hinzu und waschen Sie, indem Sie langsam zehnmal ansaugen und abgeben.
19. Sammeln Sie die Perlen, indem Sie das Röhrchen auf den Magnetständer stellen. Entfernen Sie die Überstände und entsorgen Sie diese.
Fügen Sie 1,2 μl der DNA-Kontrollverdünnung hinzu.
Fügen Sie 17,8 μl MagBead-Bindepuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie langsam zehnmal ansaugen und wieder abgeben.
22. Bei 4 °C bis zur Verwendung aufbewahren.

Sequenzierung

1. Laden der Probenplatte: Übertragen Sie die angegebenen Volumina (19 μl) in separate Wells einer neuen 96-Well-PCR-Platte zur Verarbeitung auf dem PacBio RS.
2. Laden Sie die Reagenzien, Spitzen und SMRT-Zellen in den Sequencer und starten Sie die Sequenzierung: Die Reagenzien und SMRT-Zellen variieren je nach verwendetem Sequencer, daher beziehen Sie sich auf die Einzelheiten.

Referenz:

1. Ambardar S, Gowda M. Hochauflösende Vollgen-HLA-Typisierungsmethode unter Verwendung der Sequenzierungstechnologie der dritten Generation (Pac-Bio SMRT) [M]//HLA-Typisierung. Humana Press, New York, NY, 2018: 135-153.