Vollständige HLA-Genotypisierung mit Nanoporen-Sequenzierungsprotokoll

Einführung in die vollständige HLA-Genotypisierung mit Nanopore-Sequenzierung

HLA-Gene zeigen signifikanten Polymorphismus und besitzen eine entscheidende Funktion im Immunsystem durch die Präsentation von Peptidantigenen an T-Zellen. Präzise Genotypisierung diese Gene hat eine wesentliche Bedeutung für verschiedene Bereiche, einschließlich Transplantation, Studien zur Krankheitsassoziation und Immuntherapie. Die Technologie von Nanoporen-Sequenzierung, veranschaulicht durch Plattformen wie Oxford Nanopore Technologien (ONT)bietet die Möglichkeit, lange DNA-Fragmente zu sequenzieren, und stellt damit ein wertvolles Werkzeug zur Verfügung, um die komplexen und sich wiederholenden Segmente von HLA Gene.

Das detaillierte Protokoll für die Vollversion HLA-Genotypisierung mit Nanoporen-Sequenzierung lautend:

1. Führen Sie individuelle Langstrecken-PCRs mit einem geeigneten Langstrecken-PCR-Kit unter Verwendung von 50–200 ng genomischer DNA und Primern zur Amplifikation durch. HLA Klasse-I-Gene. Überprüfen durch Gel-Elektrophorese.
2. Führen Sie MID-PCRs mit einem geeigneten Long-Range-PCR-Kit durch, wobei für jede Reaktion unterschiedliche Barcodes/MIDs verwendet werden.
3. Pulen Sie bis zu 96 MID-PCR-Produkte zusammen. Optional kann die Menge der PCR-Produkte durch Anpassung des Volumens des gepoolten PCR-Produkts basierend auf den Intensitäten der Gel-Elektrophorese-Banden ausgeglichen werden.
4. Reinigen Sie 400 μl des Amplicon-Pools mit SPRIselect-Perlen in einem Verhältnis von 0,6× (Perlen/DNA-Volumen). Stellen Sie sicher, dass die Perlen vollständig suspendiert sind. Mischen Sie durch Inversion und zentrifugieren Sie nur kurz, sodass die Perlen dispergiert bleiben. Inkubieren Sie für 5–10 Minuten. Trennen Sie die Perlen auf einem Magnetständer. Entsorgen Sie den Überstand. Führen Sie einen Waschschritt mit 500 μl 70% Ethanol durch, während das Röhrchen auf dem Magnetständer bleibt. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt. Zentrifugieren Sie kurz und trennen Sie den Ethanol am Boden des Röhrchens von den Perlen mithilfe eines Magnetständers und entfernen Sie ihn vollständig. Lassen Sie das Pellet 2 Minuten an der Luft trocknen. Eluieren Sie mit 150 μl Wasser und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie für 5 Minuten. Trennen Sie die Perlen mit dem Magnetständer.
5. Überprüfen Sie die DNA-Konzentration.

Bibliotheksvorbereitung

1. Bereiten Sie die DNA-Endreparatur-/dA-Tailing-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
2. Inaktivierung der DNA-Endreparatur/dA-Tailing-Reaktion durch Wärme, dann kurz zentrifugieren und 100 μl in ein 1,5 ml Röhrchen überführen. Fügen Sie 60 μl 0,6× SPRIselect-Perlen zur Reinigung der DNA-Endreparatur/dA-Tailing-Reaktion hinzu.
3. Quantifizieren Sie die Rückgewinnung durch Fluoreszenz. Stellen Sie sicher, dass 700 ng bis 1 μg DNA zurückgewonnen werden.
4. Mischen Sie 22,5 μl des eluierten Amplicon-Pools mit 2,5 μl 1D-Adaptern (ONT-Kit) und 25 μl Blunt/TA Ligase Master Mix und inkubieren Sie dies 10 Minuten. Verwenden Sie Wasser, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erreichen, und fügen Sie dann 60 μl (0,6×) SPRIselect-Perlen hinzu.
5. Eluieren Sie mit 46 μl Wasser. Inkubieren Sie 5 Minuten. Verwenden Sie den Magnetständer zur Trennung und übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen.
6. Fügen Sie 5 μl BAM (ONT-Kit) und 50 μl Blunt/TA Ligase Master Mix hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten.
7. Reinigen Sie, indem Sie 60 μl (0,6×) SPRIselect-Perlen hinzufügen. Inkubieren Sie 5–10 Minuten vor der Trennung. Entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie mit 140 μl "Adapter Bead Binding"-Puffer (ONT-Kit). Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 140 μl "Adapter Bead Binding"-Puffer.
8. Lufttrocknen Sie das Pellet für 2 Minuten und eluieren Sie dann mit 15 μl Elutionspuffer (ONT-Kit). Inkubieren Sie für 5 Minuten und übertragen Sie das Überstand in ein frisches Röhrchen nach der Trennung.
9. Quantifizieren Sie die Wiederherstellung durch Fluoreszenz. Stellen Sie sicher, dass mehr als 250 ng DNA wiederhergestellt werden. Die Bibliothek ist jetzt bereit für die Sequenzierung und sollte auf Eis aufbewahrt werden.

Flusszellenqualitätskontrolle, Priming und Sequenzierung

1. Setzen Sie die Flusszelle in ein MinION MK1B ein und verbinden Sie das MinION mit dem Computer, auf dem die MinKNOW-GUI installiert ist.
2. Beschriften Sie Ihr Experiment in der MinKNOW-GUI, z. B. mit Proben-ID und Flusszellen-ID, und drücken Sie die Schaltfläche "Einreichen". Wählen Sie das Skript zur Qualitätskontrolle (QC) der Plattform unter "Operation wählen" und drücken Sie die Schaltfläche "Ausführen". Wenn die Überprüfung abgeschlossen ist, kehrt die Software zur Startseite zurück. Um den Bericht über aktive Poren zu sehen, klicken Sie auf das "Benachrichtigungsfeld". Die Anzahl der aktiven Poren sollte mehr als 800 betragen.
3. Überprüfen Sie die Flusszelle auf Luftblasen im Kanal zwischen dem Primierport und dem Array. Um Luftblasen zu entfernen, öffnen Sie den "Primierport" und ziehen Sie Puffer und Blasen heraus; beim Entfernen des Puffers sollte sichergestellt werden, dass das Sensorsystem immer mit Puffer bedeckt ist.
4. Mischen Sie 480 μl Running Buffer (RBF) (ONT-Kit) mit 520 μl Wasser. Fügen Sie 800 μl der frisch zubereiteten Priming-Lösung in den "Priming Port" hinzu. Schließen Sie den "Priming Port" und warten Sie 5 Minuten. Öffnen Sie den "SpotON Sample Port" und fügen Sie 200 μl in den "Priming Port" hinzu. Vermeiden Sie es, Luftblasen beim Pipettieren einzuführen.
5. In einem frischen Röhrchen 35 μl Running Buffer (RBF), 25,5 μl Loading Beads, 2,5 μl Wasser und 12 μl der Sequenzierungsbibliothek mischen. Tropfenweise 75 μl dieser Mischung in den "SpotOn Sample Port" geben. Den Deckel des SpotON Sample Port wieder aufsetzen und den Priming Port schließen. Den Deckel des MinION schließen.
6. Wählen Sie das entsprechende Protokollskript unter "Operation wählen" aus und starten Sie die Sequenzierung, indem Sie die Schaltfläche "Ausführen" drücken. Die Benutzeroberfläche hält Sie über den Fortschritt der Sequenzierung auf dem Laufenden; die benötigte Zeit für die Sequenzierung hängt vom gewählten Sequenzierungsprotokoll ab.

FASTQ-Extraktion und Demultiplexierung

1. Erstellen Sie ein Verzeichnis, um die FASTQ-Dateien zu speichern.
2. Laufe Albacore.
3. Laden Sie die Demultiplexing-Skripte herunter und kopieren Sie die neu erstellte FASTQ-Datei in dasselbe Verzeichnis.
4. Machen Sie das Wrapper-Skript ausführbar.
5. Führen Sie die Demultiplexing-Routine aus.

Genotypisierung

1. Öffnen Sie NGSengine.
2. Öffnen Sie ein "Neues Projekt" über die Schaltfläche Datei in der linken oberen Ecke.
3. Geben Sie einen Namen für Ihr Projekt ein und drücken Sie auf "Weiter".
4. Fügen Sie den Ordner zum Speichern der demultiplexierten Fastq-Dateien hinzu und drücken Sie auf "Weiter".
5. Eine Zusammenfassung wird angezeigt, drücken Sie "Weiter", um eine Datenübersicht für weitere Analysen zu sehen.
6. Öffnen Sie "Einstellungen" über die Registerkarte Datei in der linken oberen Ecke:
   (a) Im Abschnitt "Allgemein" die maximale Anzahl der Reads auf 10.000 setzen und die Plattform auf "Oxford Nanopore" als Sequenzierungsplattform festlegen.
   (b) Stellen Sie im Abschnitt "Locus-Standardwerte" "Amplicon" auf "Auto" und "Analysebereich" auf "Amplicon" ein. Schließen Sie problematische Abschnitte, wie Homopolymere, aus, indem Sie diese im Feld "Ignorierte Bereiche" ausschließen, nachdem Sie es auf "Benutzerdefiniert" eingestellt haben. Verwenden Sie die IPD-IMGT/HLA genomisches Koordinatensystem zur Festlegung der Regionen.
   (c) Definieren Sie im Abschnitt "Locus-Auswahl" die Loci, die im Sequenzierungslauf enthalten waren. Tragen Sie sie in die Spalte "Analyse" ein.
7. Definieren Sie die Loci, indem Sie die Maus über die zu analysierende Probe halten; klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das HLA-Locus/Loci festzulegen, die typisiert werden sollen.
8. Drücken Sie "Analysieren" für alle Proben auf der linken Seite des Bildschirms oder für eine bestimmte Probe auf der rechten Seite am Ende der Probenzeile.
9. Wenn die Datenanalyse abgeschlossen ist, wird eine Übersicht der genotypisierten Allele für die Proben angezeigt.

Fazit

Nutzung Nanoporen-Sequenzierung für die gesamte Länge HLA-Genotypisierung bietet eine robuste und sorgfältige Untersuchung der HLA-Gene. Durch die Erzeugung verlängerter Sequenzen, die das gesamte Spektrum der Gen-Sequenzen abdecken, von Exons über Introns bis hin zu regulatorischen Komponenten, verfeinert dieser Ansatz erheblich die Genauigkeit von HLA-TypisierungDieses Maß an Präzision ist von größter Bedeutung, um die Zuordnung von Organ- und Knochenmarkspendern zu Empfängern zu erleichtern, die genetischen Grundlagen von Autoimmun- und Infektionskrankheiten zu beleuchten und die maßgeschneiderte Gestaltung therapeutischer Interventionen im Bereich der Immuntherapie und Impfstoffentwicklung zu leiten.

Referenz:

1. Lang K, Surendranath V, Quenzel P, et al. Vollständige HLA-Klasse-I-Genotypisierung mit dem MinION-Nanoporen-Sequenzer//HLA-Typisierung. Humana Press, New York, NY, 2018: 155-162.