Extraktion von DNA und RNA für Metagenom- und Metatranskriptom-Sequenzierungsprotokoll

Gleichzeitige DNA- und RNA-Extraktion aus Proben

Ko-Extraktion von DNA und RNA

Für jede Extraktion werden 3 × 50-mL Greiner- und 4 × 15-mL Greiner-Röhrchen benötigt, die sorgfältig beschriftet werden sollten.
Platzieren Sie 2 g jeder Größe (2 und 3 mm) frischer und steriler Glasperlen in jedes frische 50-mL Greiner-Röhrchen.
3. Um die Extraktionsmischung für eine Extraktion vorzubereiten, mischen Sie 7,5 mL Extraktionspuffer mit 0,2 mL 20% SLS-Lösung. Berechnen Sie immer einen Überhang von einer zusätzlichen Probe für Mastermischungen.
4. Bereiten Sie einen gepufferten gesättigten Phenol und fügen Sie 10 mg 8-Hydroxychinolin pro 10 mL Roti®-Aqua-Phenol hinzu.
5. Verwenden Sie sterile Scheren und Pinzetten, um das gefrorene Filter-Sandwich in kurze Stücke zu schneiden. Legen Sie die Filterstücke in das Greiner-Röhrchen.
Fügen Sie 5 mL der Extraktionsmischung hinzu.
Fügen Sie 5 mL puffer-gesättigtes Phenol hinzu.
8. Vibrieren Sie die Mischung mit 4 m/s für 60 Sekunden. Zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 2000× g bei 4 °C. Während der Zentrifugation trennt sich die Mischung in eine untere Phenolphase mit Glasperlen, eine Interphase und eine obere wässrige Phase.
Übertragen Sie die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, in ein frisches 15-mL Greiner-Röhrchen und lagern Sie es auf Eis.
Fügen Sie 2 mL der Extraktionsmischung und 2 mL puffergesättigtes Phenol zur phenolischen Phase für eine wiederholte Phenolextraktion hinzu.
11. Mischen Sie gründlich, indem Sie das verschlossene Röhrchen vortexen, und zentrifugieren Sie erneut 20 Minuten lang bei 2000× g bei 4 °C.
12. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in die bereits gesammelte wässrige Phase aus Schritt 8. Das Volumen der zusammengeführten wässrigen Phasen beträgt etwa 5 mL. Auf Eis lagern.
13. Für die DNA-Isolierung 5 mL Tris-Base zur phenolischen Phase hinzufügen und gut mischen. Bei 4 °C für mindestens 40 Minuten, jedoch nicht länger als 3 Stunden lagern.
14. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort.

RNA-Isolation

Fügen Sie 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat zu dem Greiner-Röhrchen hinzu, das die zusammengeführten wässrigen Phasen aus dem Extraktions- und Phasentrennungsverfahren enthält.
Fügen Sie 5 mL Chloroform-Isopropylalkohol hinzu.
3. Mischen Sie kräftig durch Vortexen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 10.020× g und 4 °C, um die Phasen zu trennen.
4. Glykogen (35 μg/mL) auf Eis auftauen.
5. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Greiner-Röhrchen und wiederholen Sie die Schritte 2 und 3.
Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Greiner-Röhrchen und fügen Sie ein Volumen von 1/700 Glycogen hinzu.
7. Mischen Sie kräftig und fügen Sie ein Volumen Isopropanol hinzu, um die RNA auszufällen.
8. Mischen Sie kräftig und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei -20 °C.
9. Fahren Sie mit der DNA-Isolierung fort.

DNA-Isolierung

1. Fahren Sie mit der DNA-Isolierung fort, indem Sie das Greiner-Röhrchen mit der extrahierten DNA kräftig schütteln und 15 Minuten bei 2000 × g und 4 °C zentrifugieren.
2. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Greiner-Röhrchen.
3. Fügen Sie 2 mL 1 M Tris-Base zur unteren phenolischen Phase hinzu und wiederholen Sie das Mischen und die Zentrifugation für 15 Minuten bei 2000× g und 4 °C.
4. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in die bereits in Schritt 2 gesammelte wässrige Phase. Fügen Sie 5 ml Chloroform-Isoamylalkohol in das Röhrchen hinzu.
5. Mischen Sie durch Vortexen und zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 10.000 × g und 4 °C, um die Phasen zu trennen.
6. Übertragen Sie die obere Phase in ein frisches Greiner-Röhrchen und wiederholen Sie die Schritte 4 und 5.
7. Fügen Sie 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 1/700 Volumen Glykogen hinzu.
8. Mischen Sie kräftig. Fügen Sie 2,5 Volumen eisgekühlten reinen Ethanol hinzu, um die DNA auszufällen.
9. Mischen Sie kräftig und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei -20 °C.

Waschen und Wiederaufhängung von RNA und DNA

1. Pelletieren Sie die ausgefällten Nukleinsäuren durch Zentrifugation bei maximaler g für 30 Minuten und 4 °C.
2. Waschen Sie die Pellets zweimal mit 1 ml eisgekühltem 80%igem Ethanol. Zentrifugieren Sie bei maximaler g für 15 Minuten bei 4 °C.
3. Trocknen Sie das Pellet etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur und lösen Sie die DNA oder RNA in 200 μL 1× TE-Puffer auf.

DNA- und RNA-Reinigung

Entfernung von Rest-RNA aus DNA-Proben

1. Fügen Sie 1 μL RNase A zur extrahierten DNA hinzu.
2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde.
3. Reinigen Sie die DNA mit dem Gene Read Size Selection Kit.
4. Eluieren Sie DNA mit 2× 25 μL vorgewärmtem DEPC-behandeltem Wasser.

RNA-Reinigung

1. Fügen Sie 700 μL RLT-Puffer und 7 μL ß-ME hinzu. Gut mischen.
2. Fügen Sie 500 μL 96–100% Ethanol zur verdünnten RNA hinzu. Gut mischen. Nicht zentrifugieren. Sofort fortfahren.
3. Übertragen Sie 700 μL Probe in eine RNeasy Mini Spin-Säule, die in einem 2-mL-Sammelröhrchen platziert ist. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei 10.020 ×g. Entsorgen Sie die Durchflussflüssigkeit.
4. Wiederholen Sie Schritt 3 einmal.
5. Platzieren Sie die RNeasy Mini Spin-Säule in einem neuen 2-mL-Sammelröhrchen.
6. Fügen Sie 500 μL Puffer RPE zur Spin-Säule hinzu.
7. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei >10.020× g. Entsorgen Sie die Durchlaufflüssigkeit.
8. Fügen Sie 500 μL 80% Ethanol zur RNeasy Mini Spin-Säule hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 10.020× g.
9. Platzieren Sie die RNeasy Mini Spin-Säule in einem neuen 2-mL Sammlungstube. Öffnen Sie den Deckel der Spin-Säule und zentrifugieren Sie bei voller Geschwindigkeit für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Durchfluss und die Sammlungstube.
10. Platzieren Sie die RNeasy Mini Spin-Säule in einem neuen 1,5-mL-Sammelröhrchen. Eluieren Sie RNA zweimal mit 50 μL DEPC-behandeltem H.₂O (~95 μL Eluat) für 1 Minute bei voller Geschwindigkeit bei 4 °C.
Mischen Sie 5 μL der gereinigten RNA mit 5 μL 2× RNA-Ladefarbstoff und überprüfen Sie den Erfolg der RNA-Extraktion und -Reinigung, indem Sie sie auf einem 2%igen Agarosegel laufen lassen.

DNA-Verdau

1. Wenn die Konzentration der Nukleinsäurelösung größer als 200 ng/μL ist, mit DEPC-behandeltem Wasser verdünnen.
2. Fügen Sie 1/10 Volumen des 10× TURBO DNase Puffers (geliefert) zur RNA-Probe hinzu.
3. Fügen Sie 1/40 Volumen RiboLock RNase-Inhibitor hinzu (Endkonzentration 1 U/μL).
Fügen Sie 1 μL TURBO DNase (2 U) pro 10 μg RNA hinzu.
5. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten.
6. Fügen Sie 0,1 Volumen DNase-Inaktivierungsreagenz hinzu und mischen Sie gut.
7. Bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubieren. Gelegentlich umrühren.
Zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 1,5 Minuten und übertragen Sie die RNA in ein frisches Röhrchen.
9. Führen Sie die 16S rRNA Kontroll-PCR durch. Wiederholen Sie die Schritte 3–8 bei Bedarf.
10. Reinigen Sie die RNA mit dem RNeasy MinElute-Kit gemäß den Empfehlungen.
Eluieren Sie die RNA in 24 μL mit DEPC-behandeltem Wasser.

Kontrolle der PCR auf verbleibende DNA

1. Kombinieren Sie die folgenden Zutaten in einem sterilen, DNA-freien 0,2-mL PCR-Röhrchen: 0,25 μL 5× Phusion HF-Puffer, 0,5 μL dNTP-Mix (jeweils 10 mM), 0,75 μL 25 mM MgCl.₂und 0,25 μL HighFidelity Phusion-DNA-Polymerase (2 U/μL). Fügen Sie sterile, RNase-freie H hinzu, um ein Endvolumen von 24 μL zu erreichen.₂O.
Fügen Sie 1 μL DNase-behandeltes RNA zur Mischung hinzu.
3. Führen Sie negative Kontrollen mit dem Reaktionsgemisch ohne Template und positive Kontrollen mit E. coli DH5alpha DNA durch.
4. Verwenden Sie das folgende thermische Zyklus-Schema: Anfangsdenaturierung bei 98 °C für 30 s, 25 Zyklen der Denaturierung bei 98 °C für 10 s, Annealing bei 62 °C für 30 s, gefolgt von der Verlängerung bei 72 °C für 30 s. Abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min.
5. Überprüfen Sie den Erfolg der DNA-Verdauung, indem Sie 5 μL der PCR-Reaktion auf einem 2%igen Agarosegel laufen lassen.

Erst- und Zweistrang-Synthese

Mischen Sie 8 μL reiner RNA mit 1 μL des Reverse-Primer (20 μM) ohne MiSeq-Adapter des gewünschten Amplicons, 1 μL dNTPs (jeweils 10 mM) und 3 μL steriler RNase-freier Wasser.
2. Inkubieren Sie bei 65 °C für 5 Minuten.
3. Schnell auf Eis für mindestens 1 Minute kühlen.
4. Fügen Sie in der folgenden Reihenfolge hinzu: 4 μL 5× Reaktionspuffer, 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RiboLock-Inhibitor und 1 μL SuperScript™ III RT (200E).
5. Vortexen Sie vorsichtig und sammeln Sie die Reaktion durch kurze Zentrifugation.
6. Inkubieren Sie bei 55 °C für 1 Stunde.
7. Inkubieren Sie bei 70 °C für 15 Minuten.
8. Fügen Sie 0,5 μL RNase H (5 U/μL) hinzu.
9. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C.
10. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 65 °C.
11. Fahren Sie mit der gewünschten Amplicon-PCR fort, indem Sie 1 μL des erzeugten cDNA verwenden, oder lagern Sie die Proben bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung.