Protokoll zur Extraktion und Validierung von extrazellulären Mikro-RNAs

Körperflüssigkeitsentnahme

1. Sammeln und verarbeiten Sie die Proben im gesamten Studium auf die gleiche Weise. Bei geschlechtsspezifischen Krankheiten oder Ein-Geschlecht-Kohorten verwenden Sie die Kontrollproben des gleichen Geschlechts. Wenn eine Altersanpassung möglich ist, verwenden Sie die Proben von Patienten des gleichen oder ähnlichen Alters.
2. Bevorzugen Sie die Verwendung von Stabilisierungstuben oder anderen Stabilisierungsmitteln zur Probenentnahme, um die RNase-Aktivität in den Proben zu stoppen. Die Probenentnahme in Stabilisierungstuben sollte so schnell wie möglich erfolgen.
3. Sammeln Sie die Proben innerhalb desselben Tageszeitbereichs, idealerweise am Morgen. Verwenden Sie den frischen zweiten Morgenurin. Vermeiden Sie die Verwendung des ersten Morgenurins.
4. Vor der Operation/Diagnosetests müssen Proben vor der Operation (und einer Behandlung) entnommen werden. Berücksichtigen Sie, dass alle Medikamente, die den Patienten im Verlauf der Probenentnahme verabreicht werden, die Ergebnisse beeinflussen können.
5. Lagern Sie die gesammelten Proben in Stabilisierungstuben entweder bei Raumtemperatur oder zwischen 6 °C und 12 °C (vorzugsweise) für bis zu 1 Monat, bevor Sie mit der weiteren Verarbeitung fortfahren. Nicht einfrieren.
6. Im Falle anderer Entnahmetechniken, insbesondere ohne Stabilisierungsreagenzien, sollte eine sofortige Probenverarbeitung (Zentrifugation und RNA-Isolierung sowie Lagerung bei -80 °C) erfolgen.

Trennung der extrazellulären Fraktion

1. Führen Sie zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen durch, bei 430 × g (oder bis zu 1000 × g) für 20 Minuten bei Raumtemperatur und bei 2000 × g (oder bis zu 2500 × g) für 10 Minuten bei 4 °C. Vermeiden Sie die Verwendung stärkerer Zentrifugalkräfte, da diese einen Teil der Exosomen oder anderer Vesikel, die miRNAs transportieren, eliminieren können. Dieser Schritt mit zwei Zentrifugationen ist notwendig, um Zellen und Thrombozyten (Blut, Aszites) oder potenzielle Ausfällungen und Kontaminationen durch Zell-/Bakterietrümmer (Urin) zu entfernen.
2. Übertragen Sie die extrazellulären Fraktionen (Supernatanten) in PCR-reine Röhrchen, frieren Sie sie ein und lagern Sie die Proben kurzfristig bei -25 °C oder langfristig bei -80 °C.
3. Untersuchen Sie die Hämolyse in den Plasma-/Aszitesproben, da dies häufig bei Krebsproben oder im Falle einer suboptimalen Blutentnahme vorkommt. Hämolytische Proben sollten vermieden (oder separat behandelt) werden, da aus Erythrozyten stammende miRNAs die Ergebnisse beeinflussen können. Dies gilt auch für Urinproben, die rote Blutkörperchen enthalten und bei denen Hämolyse aufgetreten ist.

Isolation von Gesamt-RNA

1. Verwenden Sie gefrorene Probenaliquots idealerweise mit identischem Volumen, z. B. 2 mL, und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Entfernen Sie nach dem Auftauen keine möglichen Niederschläge in Urinproben, da diese miRNAs enthalten können, die an Proteine gebunden sind. Verwenden Sie jedoch nicht die rötlichen Rückstände am Boden des Röhrchens in Plasmaproben.
2. Fahren Sie fort, um die gesamte RNA zu isolieren.
3. Verwenden Sie das Plasma/Serum zirkulierende und exosomale RNA-Reinigungs-Maxikit zur RNA-Isolation aus Plasma und das Urin Total RNA Purification Maxi Kit (Slurry-Format) zur RNA-Isolation aus Urin. Alternativ können Sie eines der kommerziell erhältlichen Kits zur Total-RNA-Isolation verwenden, wobei sichergestellt werden muss, dass kleine RNAs isoliert werden. Lagern Sie die isolierte (und aliquotierte) Total-RNA bei -80 °C.

Validierung einzelner MiRNAs

1. Führen Sie eine Reverse-Transkription von totaler RNA zu cDNA unter Verwendung des TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kits und miRNA-spezifischen Stem-Loop-Primern durch. Anstelle von Vollreaktionen können verkleinerte Reaktionen bis zu einem Drittel oder der Hälfte der empfohlenen ursprünglichen Eingangsvolumina aller Reagenzien und RNA verwendet werden. Darüber hinaus kann eine erhöhte Menge an RNA angewendet werden, indem das ddH ersetzt wird.₂Das Volumen, um die resultierenden Ct-Werte in Proben mit niedriger RNA-Konzentration zu verbessern. Verwenden Sie dasselbe Eingabe-RNA-Volumen für alle Proben im Experiment.
2. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch auf Eis vor. In verkleinerten Reaktionen (7,5 μL) sollte jede Reaktion 2,08 μL nucleasefreies Wasser (ddH) enthalten.₂O), 0,75 μL 10× Reverse-Transkriptionspuffer, 0,095 μL RNase-Inhibitor (20 U/μL), 0,075 μL 100 mM dNTPs mit dTTP und 0,5 μL MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μL), in großen Mengen als Mastermix vorbereitet. Für jeden miRNA-spezifischen Mastermix 1,5 μL des RT-Primers (5×) hinzufügen und schließlich 2,5 μL der spezifischen RNA-Probe für jede Reaktion hinzufügen. Sanft durch Inversion mischen (nicht vortexen) und kurz zentrifugieren.
3. Führen Sie in einem Thermocycler die Reverse-Transkriptionsreaktion in 0,2-mL-PCR-Röhrchen unter folgenden Bedingungen durch: 16 °C für 30 Minuten, 42 °C für 30 Minuten und 85 °C für 5 Minuten. Halten Sie bei 4 °C. Das RT-Produkt (cDNA) kann bei -25 °C mindestens 2 Wochen vor der qPCR gelagert werden.
Verwenden Sie 96-Well-PCR-Platten gemäß dem qPCR-Cycler, drei Wells pro Probe, d.h. eine Probe in dreifacher Ausführung.
5. Kombinieren Sie die Proben der verglichenen verschiedenen Gruppen (z. B. Krebs vs. Kontrollen) auf einer Platte, wenn möglich, idealerweise für die untersuchten miRNAs und auch die notwendigen endogenen Kontrollen zur Normalisierung.
6. Keine Vorlage-Kontrollen (nur Mastermix mit spezifischem Primer ohne cDNA) sollten einbezogen werden.
7. Führen Sie verkleinerte (10 μL) qPCR-Reaktionen durch. Bereiten Sie ein Reaktionspremix bestehend aus TaqMan Universal PCR Master Mix (2×) oder Xceed qPCR Probe 2× Mix HI-ROX Puffer (5 μL), nukleasefreiem Wasser (3,8 μL) und miRNA-spezifischem kleinen RNA-Assay (20×) (0,5 μL) vor (Volumina gelten für eine Reaktion; es sollten drei Reaktionen pro Probe durchgeführt werden), einschließlich überschüssiger Volumina (15%) für Pipettierverluste.
8. Aliquot-Reaktionspremix in Röhrchen für dreifache Reaktionen (d.h. 32 μL mit Reserve); Fügen Sie für jede Probe cDNA-Produkt (7,5 μL) aus der reversen Transkription durch sanftes Pipettieren hinzu. Kurz zentrifugieren.
9. Aliquotieren Sie 10 μL des Premixes mit cDNA in Dreifachbestimmungen für jede Probe in die MicroAmp Optical 96-Well Reaktionsplatte und verschließen Sie diese. Falls Sie das Bio-Rad CFX Connect verwenden, nutzen Sie PCR-Platten, 96-Well, ohne Rand, und Microseal 'B' PCR-Plattenversiegelungsfolie.
10. Zentrifugieren Sie die Platte (z. B. bei 700 × g bis 1300 × g) mit einer geeigneten Zentrifuge und einem Rotor (z. B. Eppendorf 5430) für 1,5 bis 3 Minuten.
11. Führen Sie Echtzeit-PCR-Reaktionen mit einem qPCR-Thermocycler durch (z. B. 7900HT Fast Real-Time PCR System oder Bio-Rad CFX Connect). Verwenden Sie die folgenden Parameter für den Thermocycler: 50 °C für 2 Minuten und 95 °C für 10 Minuten. Für 40 Zyklen verwenden Sie Folgendes: 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 1 Minute (oder 30 Sekunden im Schnellmodus).