Nachweis von DNA 5-Methylcytosin (5mC) durch Nanopore-Sequenzierungsprotokoll

Genomische DNA-Extraktion

Phenol-Chloroform Genomische DNA-Extraktion gefolgt von Ethanol-Präzipitation

1. Homogenisieren Sie Zebrafischembryonen in 200 μL Homogenisierungspuffer und inkubieren Sie die Probe bei 55℃ für nicht länger als 2 Stunden. Kippen Sie das Röhrchen mehrmals, um sicherzustellen, dass die Embryonen nach der Inkubation homogenisiert sind.
2. Um RNA-Kontamination zu entfernen, inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 95 °C. Fügen Sie 1 μL RNase A pro 100 μL homogenisierte genomische DNA hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
3. Führen Sie zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen an den Proben durch. Fügen Sie Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol im Verhältnis 1:1 zur Probe hinzu (ca. 200 μL). Kippen Sie das Röhrchen mehrmals, um die Lösungen zu mischen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 13.000 U/min (16.000 rcf).
4. Entfernen Sie etwa 180 μL aus der wässrigen oberen Schicht der gemischten Lösungen und übertragen Sie es in ein neues Eppendorf-Röhrchen, wobei Sie darauf achten, keine Lösung aus der Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Phase zu entnehmen. Wiederholen Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion mit der separierten wässrigen Schicht.
5. Fügen Sie 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2), 2,5 Volumen eiskaltes, absolutes Ethanol und 2 μL lineares Acryamid zu genomischer DNA hinzu. Fällung bei -80℃ für 30 Minuten bis 1 Stunde oder bei -20℃ für mindestens 1 Stunde. Verlängerte Fällungszeiten (wie über Nacht) können die Ausbeute erhöhen.
6. Nach der Fällung Proben 5 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Überstand entfernen und Pellet in 500 μL kaltem 70%igem Ethanol waschen. Proben 5 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Überstand entfernen.
7. Pellet in nucleasefreier Wasser oder Elutionspuffer auf das gewünschte Volumen resuspendieren. Bei -20 ℃ lagern.

Qualitätskontrolle

1. Verwenden Sie einen empfindlichen fluorometrischen Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Menge an genomischer DNA in Ihrer Probe genau zu quantifizieren. Mindestens 1 μg gDNA sollte in Ihrer Probe vorhanden sein. Verwenden Sie das NanoDrop 2000 Spektrophotometer, um die Reinheit der gDNA-Probe zu bestimmen. Die folgenden Parameter sollten beim Sequenzieren einer Probe erfüllt sein.
2. Führen Sie gDNA auf einer TapeStation mit Genomic DNA ScreenTape Analyse-Reagenzien aus, um die Größenverteilung der DNA-Fragmente zu bestimmen. Wenn DNA-Fragmente kürzer als 1 kb vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 3 fort. Wenn DNA-Fragmente größer als mindestens 1 kb sind, fahren Sie mit der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung fort.
3. DNA-Fragmente, die kürzer als 1 kb sind, können gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt werden. Dieses Protokoll führt zu einer nahezu vollständigen Depletion von Fragmenten unter 5 kb und einer progressiven Depletion von Fragmenten unter 10 kb. Die Rückgewinnungseffizienz beträgt etwa 50–90 % des Eingangs-DNA. Um sicherzustellen, dass die Probe alle Anforderungen an die Größenauswahl erfüllt, wiederholen Sie alle in der Qualitätskontrolle beschriebenen Schritte nach der Größenauswahl.

Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung

Die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung erfolgt mit dem Ligation Sequencing Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alternativ kann die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung in einer Einrichtung durchgeführt werden, die Nanopore-Sequenzierungsdienste anbietet.

Referenz:

1. Angeloni A, Ferguson J, Bogdanovic O. Nanopore-Sequenzierung und Datenanalyse für die Basisauflösungs-Genome-weite 5-Methylcytosin-Profilierung[M]//Chromatin. Humana, New York, NY, 2022: 75-94.