CRISPR-Screening und Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen

Im Wettbewerb mit Bakteriophagen haben Bakterien und Archaeen einzigartige Methoden zur Verteidigung entwickelt, zu denen die CRISPR/Cas-Systeme gehören, die Immunsysteme von Bakterien und Archaeen, um die Invasion von fremden DNAs oder RNAs zu widerstehen, die fremden eindringenden Nukleinsäuren zu erkennen und sie zur immunologischen Verteidigung zu spalten.

Derzeit sind CRISPR/Cas-Systeme zu effizienten und praktischen Forschungswerkzeugen geworden, die im Bereich der Gentechnik weit verbreitet sind. Zum Beispiel schneidet das Cas9-Enzym im Rahmen eines durch CRISPR/Cas9 induzierten Genbearbeitungsprozesses die doppelsträngige DNA spezifisch mit Hilfe von sgRNA (small guide RNA). Die Zelle erreicht die gezielte Genbearbeitung durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder homologe gerichtete Reparatur (HDR).

Inzwischen können CRISPR/Cas-Systeme problemlos für das genomweite Screening hochskaliert werden. CRISPR-Screening ist ein großangelegter genetischer Verlust-of-Function-Screen-Ansatz, der eine Population von mutierten Zellen erzeugt und untersucht, um die Entdeckung wichtiger Gene oder genetischer Sequenzen in einem bestimmten Zelltyp zu erleichtern. Die Grundidee des CRISPR-Screenings besteht darin, jedes Gen im Genom, das wichtig sein könnte, auszuschalten und dabei nur ein Gen pro Zelle.

Der Arbeitsablauf des genomweiten CRISPR/Cas9 Knockout-Screenings und der Sequenzierung

1. sgRNA-Bibliothekskonstruktion: sgRNAs werden computergestützt entworfen, synthetisiert, durch PCR amplifiziert und in ein Vektorliefersystem kloniert.

2. Screening: Führen Sie sgRNA, Cas9 und andere notwendige Komponentenbibliotheken in die Zellen ein. Anschließend werden die gewünschten Klone ausgewählt und DNA extrahiert.

3. Sequenzierung: PCR und Next-Generation-Sequencing.

4. Messung & Analyse: sgRNAs werden zurückgewonnen, analysiert und assoziierte Gene identifiziert.

Anwendungen von CRISPR-Screening und Sequenzierung

Um krankheitsbezogene Gene zu identifizierenDas genomweite CRISPR/Cas9-Screening kann verwendet werden, um krankheitsbezogene Gene zu identifizieren, was wichtig für die Entdeckung neuer Arzneimittelziele ist und Strategien für die Behandlung bietet. Zum Beispiel sind CRISPR/Cas9-Screening-Technologien ein Segen für die Krebstherapie – Zielgene können ermittelt und analysiert werden, um Gene mit einer höheren Korrelation zur Überlebensfähigkeit von Tumorzellen zu finden. Durch die Unterdrückung der Expression dieser Gene wird der Zellzyklus der Tumorzellen blockiert und Apoptose induziert, während normale Blutkörperchen nicht so stark betroffen sind. CRISPR/Cas9-Screening kann auch verwendet werden, um metastasierungsbezogene Gene zu untersuchen, um zu erforschen, wie Viren in Wirtszellen eindringen und diese schädigen, und mehr.

Nicht-kodierende Sequenzen zu untersuchenNicht-kodierende DNA-Sequenzen, die etwa 98 Prozent der menschlichen Genomsequenz ausmachen, umfassen nicht-kodierende RNA, cis- und trans-regulatorische Elemente, Introns, Pseudogene, Telomere, repetitive Sequenzen und so weiter. Studien haben gezeigt, dass nicht-kodierende Sequenzen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression, Tumorentstehung, Immunregulation, Ontogenese und vielen anderen biologischen Prozessen spielen. Genomweite CRISPR-Screenings können angewendet werden, um unbekannte nicht-kodierende DNA-Sequenzen zu untersuchen, die von großer Bedeutung für das Verständnis der Genregulation, von Krankheiten und biologischer Evolution sind.

Regulatorische Netzwerke zu untersuchenCRISPR/Cas9-Genome-weite Screening wurde in verschiedenen Bereichen der Zellbiologie weit verbreitet angewendet. Allerdings wird das Screening von Phänotypen hauptsächlich in Bezug auf Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Arzneimittelresistenz und die Expression von Reportergen durchgeführt. Komplexere biologische Regulationsnetzwerke (wie Transkriptom, Geninteraktion) innerhalb von Zellen bedürfen weiterer Forschung. Durch die Kombination der CRISPR/Cas9-genomischen Screening-Technologie und der Einzelzell-Sequenzierung kann die Expression von sgRNA genau erfasst und die Veränderungen des Gen-Transkriptionsniveaus in Zellen gemessen werden. In der Zwischenzeit können große Datenmengen gemäß dem Computermodell analysiert und das komplexe Gen-Netzwerk dargestellt werden.