CRISPR-Screen-Sequenzierungsprotokoll

Genomische DNA-Isolation

1. Reinigen Sie die Genom-DNA-Station mit 10% Bleichmittel, gefolgt von Wasser und schließlich 70% Ethanol. Bereiten Sie Aliquots der benötigten Mengen der Lösungen des Wizard Genomic DNA Purification Kit vor. Erwärmen Sie den TE-Puffer (Rehydratationslösung) auf 65 °C und bereiten Sie 70% Ethanol (für Proben) mit UltraPure-Wasser vor.
2. Auftauen der Zellpellets bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten.
3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS und übertragen Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das ursprüngliche Röhrchen mit 400 μl PBS aus und fügen Sie es demselben 50-ml-Röhrchen hinzu.
Fügen Sie 5 ml Nuclei Lysis Solution zu den resuspendierten Zellen hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren mit einer 10-ml-Pipette (fünfmal).
Fügen Sie 32 μl RNase A (20 mg/ml Lagerlösung; Endkonzentration von 100 μg/ml) zum nukleären Lysat hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen fünfmal umdrehen. Inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten und lassen Sie es dann auf Raumtemperatur abkühlen (~10 Minuten).
6. Fügen Sie 1670 μl Proteinpräzipitationslösung zum nukleären Lysat hinzu und vortexen Sie kräftig für 20 Sekunden.
7. Zentrifugieren Sie bei 4500 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Übertragen Sie mit einer 10-ml-Pipette den Überstand in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das 5 ml Isopropanol enthält. Achten Sie darauf, kein Präzipitat zu übertragen.
9. Mischen Sie die Lösung vorsichtig zehnmal durch Umkehren, bis die weißen fadenartigen DNA-Stränge eine sichtbare Masse bilden.
10. Zentrifugieren Sie bei 4500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Die DNA wird als kleines weißes Pellet sichtbar sein.
11. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um das Pellet nicht zu lösen. Fügen Sie 5 ml 70% Ethanol zur DNA hinzu. Drehen Sie das Röhrchen sanft, um das DNA-Pellet und die Wände des Zentrifugenröhrchens zu waschen.
Zentrifugieren Sie bei 4500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Entfernen Sie vorsichtig und gründlich allen Ethanol, um das Pellet nicht zu lösen. Lassen Sie die genomische DNA bei Raumtemperatur 10–30 Minuten an der Luft trocknen, bis das Pellet durchscheinend erscheint. Trocknen Sie nicht zu lange (bevor sichtbare Risse auftreten). Vermeiden Sie Kontamination durch Staubpartikel.
14. Fügen Sie 400 μl TE-Puffer (DNA-Rehydrierungslösung) hinzu und lassen Sie die DNA bei 65 °C für 1–4 Stunden auflösen. Mischen Sie die DNA, indem Sie alle 15 Minuten sanft am Rohr flicken, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist. Die Suspension kann leicht viskos sein, sollte jedoch keine Klumpen von DNA enthalten.
Zentrifugieren Sie bei 4500 × g für 1 Minute bei Raumtemperatur und übertragen Sie die genomische DNA in ein 1,5-ml-Niedrigbindungsröhrchen.
16. Quantifizieren Sie DNA mit einem Qubit-Fluorometer und lagern Sie sie bei −20 °C.

Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung

1. Immer die T0-Probe einbeziehen, um die Bibliotheksrepräsentation im Screening zu bestimmen und die Berechnung der gRNA-Faltänderung zu ermöglichen.
2. Reinigen Sie die PCR1- und PCR2-Arbeitsstationen mit 10% Bleichmittel, gefolgt von Wasser und schließlich 70% Ethanol.
3. Bereiten Sie ein 1% Agarosegel mit SYBR Safe DNA-Färbung vor, um die amplifizierten Produkte von PCR1 zu überprüfen. PCR1 reichert das gRNA-Kassette aus dem Genom an.
4. Im PCR-Hood: richten Sie eine diagnostische Reaktion ein (fügen Sie noch kein genomisches DNA hinzu) und eine Negativkontrolle ohne Template.
5. Überprüfen Sie die PCR-Amplifikation, indem Sie 2 μl des PCR-Produkts auf dem vorbereiteten Agarosegel laufen lassen. Die erwartete Produktgröße beträgt etwa 600 bp.
6. Amplifizieren Sie die PCR1-Reaktionen in einem Thermocycler mit dem Programm.
7. Gehen Sie zur PCR2-Arbeitsstation und fassen Sie alle 14 + 1 (diagnostischen) PCR1-Reaktionen in einem 1,5-ml-Mikrocentrifugenröhrchen zusammen.
8. Tauchen Sie die Agarosegel-Ausrüstung (Geltablett, Kamm und Gelbehälter) zur Reinigung der amplifizierten PCR2-Produkte 10 Minuten lang in 0,1 N HCl, bevor Sie das Gel gießen. Spülen Sie viermal mit Leitungswasser und einmal mit gereinigtem Wasser.
9. Bereiten Sie ein 2%iges Agarosegel mit SYBR Safe DNA-Färbung zur Reinigung der PCR2-amplifizierten Produkte vor. Verwenden Sie große Kämme und lassen Sie ausreichend Platz zwischen den Proben. PCR2 amplifiziert die gRNA-Kassette und fügt Illumina TruSeq-Adapter mit i5- und i7-Indizes hinzu.
10. Richten Sie PCR2-Reaktionen ein (fügen Sie noch kein Template-PCR1-Produkt hinzu). Bereiten Sie nach Bedarf Kontrollen ohne Template vor.
11. Führen Sie die vollständige PCR2-Reaktion auf dem vorbereiteten 2%igen Agarosegel bei niedriger Spannung (1,5–2 Stunden Laufzeit) durch. Visualisieren Sie das PCR-Produkt auf einem Blaulicht-Transilluminator, die erwartete Produktgröße beträgt ca. 200 bp. Mehrere Banden können sichtbar sein; es ist wichtig, die Banden gut zu trennen.
12. Schneiden Sie das 200 bp-Band mit einer neuen Rasierklinge aus und übertragen Sie den Gelabschnitt in ein 1,5-ml-Röhrchen.
13. Reinigen Sie DNA aus einem Agarosegel-Slice mit einem Gel-Extraktionskit. Wir empfehlen, jeden Bindungsschritt zweimal zu wiederholen und bei großen Bindungsvolumina zwischendurch mit Bindepuffer zu waschen. Wir empfehlen außerdem eine doppelte Elution, um den Ertrag zu maximieren.
14. Lag gel-purifiziertes DNA in einem 1,5-ml-Niedrigbindungsröhrchen.
15. Quantifizieren Sie DNA mit dem Qubit-Fluorometer.

Next-Generation Sequencing

1. Aufgrund von Unterschieden in den Anforderungen an die Probenübermittlung und den Qualitätskontrollen, die von Einrichtungen und Anbietern der Next-Generation-Sequenzierung angewendet werden, geben wir in diesem Abschnitt nur allgemeine Empfehlungen.
2. Sequenzierungsbibliotheken können jetzt zusammengeführt werden. Der Grad der Multiplexierung hängt von der gewünschten Lesetiefe pro Probe ab. Für Dropout-Screenings empfehlen wir, jede Probe mit einer 200-fachen Bibliotheksabdeckung und einer 500-fachen Abdeckung für T0-Proben zu lesen, um die Robustheit während der Datenanalyse aufgrund des Fehlens unabhängiger Replikate bei T0 zu gewährleisten. Für starke positive Selektionsscreenings, die auf die Identifizierung angereicherter gRNAs abzielen, kann eine 50-fache Abdeckung ausreichend sein.
3. Sequenzierung auf Illumina HiSeq2500 oder NextSeq550 mit Standardprimern für die duale Indizierung.

Referenz:

1. Mair B, Aregger M, Tong A H Y, et al. Eine Methode zur Kartierung der Genessenzialität von menschlichen pluripotenten Stammzellen durch genomweite CRISPR-Screenings mit induzierbarem Cas9[J]. Essentielle Gene und Genome: Methoden und Protokolle, 2022: 1-27.