Coronavirus-Identifizierung durch metagenomische Sequenzierungsmethoden

Probenvorbereitung

1. Poolen Sie die Darminhalte von experimentell infizierten Perlhuhn-Küken und resuspendieren Sie sie in 500 μl PBS mit Penicillin und Streptomycin. Vortexen.
2. Filtern Sie die Lösung (0,45 μm Filter), um eukaryotische und bakterielle Zellpartikel zu entfernen.
Zentrifugieren Sie den Verdauungsinhalt zweimal 30 Minuten lang bei 10.000 × g, um die Lösung zu klären, und sammeln Sie das Überstand in einem neuen Röhrchen.

Konzentration von Viruspartikeln

Pelletieren Sie das konzentrierte Material durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 2 Stunden.
2. Mit RNAse und DNAse behandeln, um nicht partikelgeschützte Nukleinsäuren zu entfernen: Mischen Sie 500 μl Probe, 10 μl DNAse (100 U), 12 μl RNAse (20 μg/μl), 60 μl 10× DNAse-Puffer und 16 μl PBS. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten bei 37 °C und dann 10 Minuten bei 75 °C, um die Reaktion zu stoppen.

RNA-Extraktion und Amplifikation

Fügen Sie 750 μl TRIzol zu 250 μl Probe hinzu, Schritt 2, und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Fügen Sie 200 μl Chloroform hinzu, vortexieren Sie kräftig und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 11.000 × g bei 4 °C.
4. Sammeln Sie die oberste wässrige Phase.
5. Extrahieren Sie RNA aus 150 μl der gesammelten wässrigen Phase mit einem Silikat-Säulenkits zur RNA-Extraktion.
6. Führen Sie eine Rücktranskriptionsreaktion mit zufälligen Primern durch, indem Sie 7,5 μl RNA und 5 μl markierte zufällige Hexamere mischen.
7. Inkubieren Sie bei 65 °C für 5 Minuten und lagern Sie dann auf Eis.
8. Fügen Sie 4 μl 5× Reaktionspuffer, 0,5 μl RNase-Inhibitor, 2 μl dNTP und 1 μl RevertAid Reverse-Transkriptase hinzu.
9. Inkubieren Sie bei 25 °C für 10 Minuten, 42 °C für 60 Minuten und 70 °C für 10 Minuten.
10. Reagenzien können jetzt bei −20 °C gelagert oder sofort für die PCR verwendet werden.
11. Führen Sie eine zufällige PCR durch, indem Sie 10 μl 5× Phusion HF Reaktionspuffer, 1 μl dNTP, 0,5 μl nur Tag-Primer, 5 μl cDNA, 0,5 μl Phusion-Polymerase und 33 μl Wasser mischen.
12. Führen Sie die PCR mit folgendem Zyklus durch: 98 °C 30 s, gefolgt von 40 Zyklen bei 98 °C 10 s, 65 °C 20 s und 72 °C 30 s, gefolgt von einer finalen Inkubation bei 72 °C 10 min.
13. Analysiere die PCR-Produkte in einem 1 % Agarosegel, migriere 1 Stunde bei 60 V.
14. Schneiden Sie die 300 bp Banden aus und führen Sie eine Gelreinigung mit einem kommerziellen Kit durch.
15. Qualitätsbewertung der vorbereiteten Bibliothek: quantifizieren Sie die erzeugte DNA mit einer fluoreszenzbasierten Methode (PicoGreen®-Quantifizierungsassay) und streben Sie 1 μg DNA als Eingabe an; überprüfen Sie die DNA-Qualität und zielen Sie auf ein 260:280-Verhältnis >1,8.

Cluster-Generierung mit dem Miseq-Reagenzkit (Illumina)

1. Proben mit der Flusszelle hybridisieren.
2. Amplify-Muster (Brückenverstärkung).
3. Fragmente linearisieren.
4. Blockfragmente.
5. Hybridisierungssequenzierprimer.

Sequenzierung auf dem Miseq (Illumina)

1. Der Bibliotheks-DNA-Fragment fungiert als Vorlage, von der ein komplementärer Strang synthetisiert wird.
2. ddNTPs werden nacheinander hinzugefügt (ein Zyklus = ein ddNTP hinzugefügt, ein Bild aufgenommen und die Defluorierung des ddNTPs, um im nächsten Zyklus ein neues ddNTP hinzufügen zu können) von einer DNA-Polymerase. Die Hinzufügung von ddNTP wird digital als Sequenzdaten Zyklus für Zyklus aufgezeichnet.

Datenanalyse

1. Bereiten Sie die Daten vor, um Adaptersequenzen zu entfernen und eine Demultiplexierung mithilfe von splitbc durchzuführen (mehrere Proben können multiplexiert und gemeinsam auf dem MiSeq Illumina-Sequenzer ausgeführt werden, um die Kosten zu senken).
2. Verarbeiten Sie die Daten vor, um niedrigqualitative Reads zu entfernen und gepaarte Sequenzen mit illuminapairedend zu kombinieren.
3. Ordnen Sie die Daten einem Referenzgenom zu oder führen Sie eine de novo Ausrichtung der Sequenzreads durch (Ausrichtung mit bwa, Konsens wird mit dem SAMtools-Softwarepaket berechnet. Anzeigen der Ergebnisse mit dem IGV-Browser).
4. Analysiere die kompilierte Sequenz mit der GAAS-Software mit einem erwarteten Wert von 10−3.