Chromatin-Immunopräzipitations-Sequenzierung (ChIP-seq) Protokoll

Vorbereitung von Zellaufschlägen und Gewebelysaten

Trypsinieren Sie die kultivierten adhärenten Zellen und suspendieren Sie sie in PBS. Alternativ können die Zellen nach der Fixierung von der Kulturplatte abgeschabt werden. Typischerweise 10⁶–10⁷ Zellen werden für eine einzelne IP verwendet; jedoch variiert die optimale Zellanzahl je nach verwendetem Antikörper. Für die Vorbereitung von Gewebe-Lysaten frieren Sie frisch isolierte Gewebeschnitte (30–100 mg) in flüssigem Stickstoff schnell ein und homogenisieren Sie diese dann in PBS mit einem Dounce-Homogenisator (1–2 mL) mit einem lockeren Kolben.

Chromatinfixierung und Fragmentierung

Histon-Modifikationen

Fügen Sie 1/10 Volumen Fixierpuffer zur Zellaufhängung oder Gewebelysat hinzu und inkubieren Sie bei 25℃ für 5–15 Minuten mit sanftem Mischen oder Rotation.
2. Fügen Sie 1/10 Volumen von 1,5 M Glycin hinzu und inkubieren Sie bei 25℃ für 3 Minuten mit sanftem Mischen oder Drehen.
3. Zentrifugieren und zweimal mit PBS waschen.
4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Lysispuffer und inkubieren Sie es 15 Minuten auf Eis. Homogenisieren Sie die Zellen zehnmal mit einer Spritze, die mit einer 21–23G Nadel ausgestattet ist. Zählen Sie die Kerne mit einem Hämozytometer oder durch DAPI-Färbung. Zentrifugieren Sie die Kerne 5 Minuten bei 4℃.
5. Resuspendieren Sie das Pellet in SD Lysepuffer mit einer Dichte von 1–2×10.⁶ Kerne/100μL und 5 Minuten auf Eis inkubieren.
6. Übertragen Sie die Zellkern-Suspension in ein Picoruptor-Röhrchen (100–300 μL/Röhrchen). Sonikationsbedingungen: 5–30 Zyklen (30 Sekunden ein/30 Sekunden aus) bei 4℃.
Zentrifugieren Sie die Mischung 5 Minuten lang bei 13.000 ×g bei 4℃ und sammeln Sie den Überstand für die nachfolgenden IP-Schritte.

Histonmodifikatoren

1. Dualer Vernetzungsprozess: Vor der Formaldehydvernetzung die Zellen/Tissulyse in 2 mM DSG suspendieren und bei 25℃ für 5 Minuten inkubieren.
2. Sonikation: Suspendieren Sie die Kerne in 1×RIPA-Puffer, der 0,1% SDS enthält, anstelle des SDS-Lyse-Puffers. Die optimale Sonikationszeit kann länger (bis zu 50 Minuten) sein als bei der Einzelkreuzvernetzungsmethode.

Immunopräzipitation

1. Preclear: Verdünnen Sie die fragmentierte Chromatinlösung zehnmal mit ChIP-Dilutionspuffer. Fügen Sie Dynabeads Protein A oder G mit 20 μL/mL hinzu und rotieren Sie bei 4℃ für 1 Stunde. Stellen Sie das Röhrchen für 5 Minuten auf einen Magnetständer und sammeln Sie den Überstand. Zu diesem Zeitpunkt stammt das Chromatin von 1–4×10⁶ Zellen werden pro 1 ml gelöst.
2. Antikörper: Behalten Sie 10 % des Inputs für die anschließende DNA-Reinigung. Fügen Sie spezifische Antikörper für Histonmodifikationen oder Modifizierer in einer Konzentration von 4–10 μg/mL hinzu. Eine parallele Probe mit einer äquivalenten Menge an Kontroll-IgG sollte vorbereitet werden. Über Nacht bei 4℃ rotieren.
3. Perlen abziehen: Fügen Sie 20 μL Dynabeads Protein A oder G hinzu und rotieren Sie bei 4℃ für 2–3 Stunden.
4. Die Perlen sollten fünfmal mit RIPA-Puffer (niedriger Salzgehalt), RIPA-Puffer (hoher Salzgehalt) und LiCl-Puffer gewaschen und zweimal mit TE. Zwischen jeder Waschung 3–5 Minuten durch Rotation mischen, zentrifugieren und auf einem Magnetständer platzieren.
5. Rückkreuzvernetzung: Suspendieren Sie die Perlen in 200 μL direktem Elutionspuffer. Fügen Sie den Eingangsproben ChIP-Dilutionspuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 192 μL zu erreichen, und fügen Sie dann 8 μL 5M NaCl hinzu. Inkubieren Sie bei 65℃ für mindestens 4 Stunden.

DNA-Reinigung

Fügen Sie 1 μL RNase A hinzu und inkubieren Sie bei 37℃ für 30 Minuten.
Fügen Sie 1 μL Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 4℃ für 1 Stunde.
3. Fügen Sie ein gleiches Volumen PCI hinzu, vortexen Sie und zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g für 5 Minuten. Sammeln Sie die wässrige Phase. Für den Rückextrakt fügen Sie TE/NaCl zum ursprünglichen Röhrchen hinzu und wiederholen Sie die Extraktion (die kombinierte wässrige Phase wird insgesamt etwa 400 μL betragen).
4. Fügen Sie 1 μL Glykogen und 900 μL 100% Ethanol hinzu. Vortexen und 5 Minuten bei -20℃ inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g für 5 Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit 70–80% Ethanol.
5. Suspendieren Sie die pelleted DNA in 50–100 μL TE.

NGS-Bibliotheksvorbereitung

1. Vor der Bibliotheksvorbereitung analysieren Sie die Größenverteilung der DNA-Fragmente mit einem TapeStation- oder Bioanalyzer-Gerät. Wenn keines von beidem verfügbar ist, führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese kombiniert mit SYBR Gold-Färbung durch, die die Detektion von DNA in niedriger Konzentration verbessert.
2. Für die Bibliotheksvorbereitung verwenden Sie ein geeignetes DNA-Bibliotheksvorbereitungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wir verwenden 20–30 ng IP-DNA oder 50–100 ng Eingangs-DNA für jede Bibliothek. Für die Bibliotheksamplifikation werden typischerweise 10–15 PCR-Zyklen verwendet.
3. Es ist wichtig zu bestätigen, dass die Größenverteilungen zwischen den erzeugten Bibliotheken äquivalent sind. Die Menge der Bibliotheks-DNA sollte mit einer qPCR-basierten Methode quantifiziert werden. Das Gen-Next NGS Bibliotheksquantifizierungs-Kit kann verwendet werden.

Referenz:

1. Pei J, van den Dungen N A M, Asselbergs F W, et al. Protokoll zur Chromatin-Immunpräzipitation-Sequenzierung (ChIP-seq) für kleine Mengen gefrorenen biobankierten Herzgewebes[M]//Chromatin. Humana, New York, NY, 2022: 97-111.