ChIP-Sequenzierung Q&A

Allgemeine Fragen

Wie entwerfe ich ein ChIP-Seq-Experiment?

(1) Berücksichtigen Sie den Einsatz spezifischer Antikörper, um DNA-Fragmente je nach Studienziel effektiv anzureichern.
(2) Für verschiedene Zelltypen müssen spezifische Methoden zur Nukleusextraktion verwendet werden, um intakte und ausreichende Kerne zu erhalten.
Die Hauptschwierigkeit bei ChIP-seq besteht in der Verfügbarkeit der für die Immunpräzipitation verwendeten Antikörper und der Fähigkeit, ausreichende Mengen intakter Zellkerne zu extrahieren.

Sollte ich ChIP-Seq oder ChIP-chip wählen?

(1) ChIP-Seq ermöglicht eine echte genomweite Analyse. Die derzeit verfügbaren Sonden, die auf dem Chip fixiert sind, repräsentieren nur Teilsequenzen des gesamten Genoms, und die gewonnenen Hybridisierungsinformationen sind verzerrt.
(2) Für die Analyse von Bindungsstellen kann ChIP-Seq eine Bindungsauflösung von 10-30 bp erreichen, indem nach "Spitzen" gesucht wird, während die Sonden auf dem Chip aufgrund ihrer Länge nicht präzise lokalisiert werden können, und selbst das höchste Niveau kommerzieller Chips, das derzeit verfügbar ist, kann keine Auflösung bieten, die mit der von ChIP-Seq vergleichbar ist.
(3) Die Anzahl der Proben ist erforderlich. ChIP-Chip benötigt bis zu 4-5 μg Probe, was eine LM-PCR vor der Hybridisierung erfordert, aber zu falsch positiven Ergebnissen aufgrund von erhöhtem Hintergrund, kompetitiver Amplifikation usw. führen kann. ChIP-Seq hingegen benötigt nur Nanogramm Ausgangsmaterial, das so niedrig wie 20 ng sein kann.

Welche Methode zur Konstruktion von ChIP-Seq-Bibliotheken verwenden Sie?

Die Illumina-Sequenzierung wird verwendet, um die ChIP-seq-Sequenzierungsbibliotheken wie folgt zu erstellen:
(1) ChIP-Anreicherung von DNA-Fragmenten.
(2) Konstruktion von Sequenzierungsbibliotheken. Nach der Reinigung der ChIP-angereicherten DNA-Fragmente wurden eine Reihe von Behandlungen wie End-Glättung, 3'-End-Zusatz und ligierte Verknüpfungen durchgeführt. Die Fragmente im Bereich von 150-300 bp wurden durch elektrophoretisches Gel-Schneiden zurückgewonnen, und anschließend wurden die zurückgewonnenen DNA-Fragmente durch PCR amplifiziert und maschinell sequenziert. Die gemessenen Sequenzen werden zunächst einer genomischen Ausrichtung unterzogen und anschließend einer Zählung der Bindungsstellen unter Verwendung verschiedener Algorithmen.

Die Hauptschritte eines ChIP-seq-Experiments sind: 1. Zellkultur und Behandlung: Zellen werden kultiviert und gegebenenfalls mit spezifischen Stimuli behandelt. 2. Quervernetzung: Die Zellen werden mit Formaldehyd behandelt, um Protein-DNA-Komplexe zu stabilisieren. 3. Zelllyse: Die Zellen werden lysiert, um die DNA und die gebundenen Proteine freizusetzen. 4. Chromatinfragmentierung: Die DNA wird durch enzymatische Verdauung oder sonication in kleinere Fragmente zerlegt. 5. Immunpräzipitation: Ein spezifisches Antikörper wird hinzugefügt, um das Zielprotein und die daran gebundene DNA zu isolieren. 6. Reinigung: Die immunopräzipitierten DNA-Protein-Komplexe werden gereinigt, um ungebundene DNA und Proteine zu entfernen. 7. DNA-Extraktion: Die DNA wird von den Proteinen getrennt und gereinigt. 8. Bibliotheksvorbereitung: Die gereinigte DNA wird für die Sequenzierung aufbereitet, einschließlich der Anfügung von Adaptern. 9. Sequenzierung: Die DNA-Bibliothek wird sequenziert, um die Sequenzen der gebundenen DNA zu bestimmen. 10. Datenanalyse: Die Sequenzdaten werden analysiert, um Bindungsstellen und Muster der Protein-DNA-Interaktion zu identifizieren.

Ist die PCR-Amplifikation während des Probenvorbereitungsprozesses erforderlich und beeinflusst sie das Endergebnis nach der PCR-Amplifikation?

Da die Menge an DNA-Proben aus ChIP sehr gering ist, ist ein PCR-Amplifikationsschritt während des Probenvorbereitungsprozesses erforderlich. Der Hauptzweck der PCR-Amplifikation besteht darin, eine ausreichende Menge an DNA für die Online-Reaktion zu erhalten. Wenn der Kunde eine ausreichende Menge an DNA-Proben bereitstellen kann, führen wir keine PCR-Amplifikation mehr durch. Da es sich um eine lineare Amplifikation handelt, sind die Ergebnisse vor und nach der Amplifikation sehr ähnlich und beeinflussen grundsätzlich nicht die Sequenzierungsergebnisse.

Welche anderen Faktoren können die Ergebnisse von ChIP-Seq beeinflussen?

Wie wählt man Antikörper für Chip-Seq aus?

(1) In Bezug auf die Qualitätsanforderungen an Antikörper sollten Antikörper für ChIP-Experimente von ChIP/IP-Qualität oder höher sein.
(2) Wenn Sie die Bindungsstelle eines bestimmten Transkriptionsfaktors im gesamten Genom untersuchen möchten, müssen Sie einen spezifischen Antikörper verwenden, der mit diesem Transkriptionsfaktor als Antigen erzeugt wurde. Wenn der Antikörper schwer zu beschaffen oder nicht effektiv ist, können Sie auch versuchen, einen markierten Antikörper zu verwenden, der besser geeignet ist, wenn das Subjekt eine Pflanze ist.
(3) Es können markierte Antikörper wie His, GFP, Flag, HA usw. ausgewählt werden. Es gibt jedoch einige Risiken, die mit dem Tag-System verbunden sind. Erstens, ob die Fusion des Tag-Proteins die Fähigkeit des Transkriptionsfaktors, an DNA zu binden, beeinträchtigt. Zweitens, ob das Tag-Protein selbst die Fähigkeit hat, an DNA zu binden, was zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Schließlich, ob das Tag-Fusionsprotein mit dem ursprünglichen Transkriptionsfaktor um die Bindung an DNA konkurriert und die ChIP-Anreicherung schwächt.

Wie man die Eingabesteuerung für ChIP-Sequenzierung einrichtet.

Vor der Immunpräzipitation müssen Sie einen Teil des gebrochenen Chromatins für die Input-Kontrolle entnehmen. Die Input-Kontrolle ist die gebrochene genomische DNA, die eine Rückvernetzung, DNA-Reinigung und abschließende PCR oder andere Methoden durchlaufen muss, um zusammen mit der präzipitierten Proben-DNA nachgewiesen zu werden. Die Input-Kontrolle kann nicht nur die Wirkung der Chromatinzerstörung überprüfen, sondern auch zur Berechnung der Effizienz von ChIP verwendet werden.

Wie man positive und negative Kontrollen für ChIP-Sequenzierung einrichtet.

Positive und negative Kontrollen sind die grundlegendsten experimentellen Kontrollen. Positive Kontrollen wählen in der Regel Antikörper gegen konserviertere Proteine, die an bekannten Sequenzen binden; häufig verwendete sind Histon-Antikörper oder RNA-Polymerase-II-Antikörper usw. Negative Kontrollen werden normalerweise aus IgG oder Serum des Wirts des Zielprotein-Antikörpers ausgewählt. Die Ergebnisse des Zielprotein-Antikörpers werden mit positiven und negativen Kontrollen verglichen, um die richtigen Schlussfolgerungen zu ziehen.
Wenn das Zielprotein kein kommerzielles Antikörper hat, das für Chromatin-Immunpräzipitations-Assays geeignet ist, und nur Antikörper für andere Zwecke verfügbar sind, kann zunächst ein Protein-Immunpräzipitationstest durchgeführt werden. Wenn der Antikörper das Protein erfolgreich präzipitieren kann, wird der Chromatin-Immunpräzipitations-Assay durchgeführt.

Welche Faktoren führen zu falsch positiven Ergebnissen bei ChIP-Seq?

Die Hochdurchsatz-Sequenzierung verbessert zwar erheblich die Auflösung von ChIP-Assays, ist jedoch nicht der einzige Faktor für eine hohe Auflösung. Die Länge der unterbrochenen Chromatinfragmente nach der Immunanreicherung beeinflusst ebenfalls die Auflösung. Methoden zur DNA-Fragmente, Chromatinzugänglichkeit, PCR-Amplifikationsbias, Genomduplikation und Fehler bei der Sequenzierung und Sequenzausrichtung können alle systematische Fehler einführen, die zu falsch positiven Ergebnissen führen.

Welche Datenverarbeitungsmethoden können verwendet werden, um die Zuverlässigkeit von ChIP-seq-Rohdaten zu schätzen?

Nach der Sequenzierung werden die Sequenzen zunächst mit bekannten Genomen abgeglichen und die tatsächlichen Bindungsstellen (Spitzen) festgelegt. Bei Transkriptionsfaktoren werden die downstream-regulatorischen Gene (Zielgene) gesucht, die den "Spitzen" entsprechen, oder es werden konservierte Bindungssequenzen für die Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren konstruiert. Wenn die Motive der Transkriptionsfaktoren bekannt sind, kann der Prozentsatz der "Spitzen", die die Motivsequenzen enthalten, berechnet werden. Wenn das Motiv des Transkriptionsfaktors bekannt ist, kann der Prozentsatz der Motivsequenzen in der "Spitzen"-Sequenz berechnet werden, was indirekt die Zuverlässigkeit der experimentellen Ergebnisse abschätzen kann.

Muss ich nach ChIP qPCR-Analysen durchführen?

Ein qPCR-Assay wird normalerweise nach Abschluss der ChIP durchgeführt. Wenn Sie Histonmodifikationen untersuchen, ist ein Gen, das durch das Histon modifiziert, aber nicht von der Histonmodifikation betroffen ist, als Kontrolle für qPCR erforderlich. Ein hoher Anreicherungsploidy (Behandlung/Eingang) des Gens wird auf eine signifikante Anreicherung der ChIP hinweisen. Wenn die Studie sich mit Transkriptionsfaktoren befasst, können mehrere Primerpaare für potenzielle Zielgene gegen deren Genregionen und Promotorregionen entworfen werden, um die Spezifität der ChIP-Anreicherung zu testen.

Was ist der Unterschied zwischen Agaroseperlen und magnetischen Perlen während der Immunpräzipitation, und welche Perlen sind effektiver?

Agaroseperlen haben eine unspezifische Bindung und müssen daher mit Chromatin vorgewaschen werden, um Proteine oder DNA zu entfernen, die möglicherweise unspezifisch an Protein G-Agarose gebunden sind, und die Schichtung ist nicht offensichtlich, wodurch Proben leicht verloren gehen können. Der Vorteil von magnetischen Perlen besteht darin, dass die Probe nicht zentrifugiert werden muss, die Betriebszeit kurz ist und die Oberfläche der Perlen glatt ist und der Hintergrund niedrig ist, wodurch die Notwendigkeit einer Behälterung entfällt. Ein weiterer Vorteil von magnetischen Perlen ist, dass sie farbcodiert sind und eine klare Schichtung aufweisen, sodass die Probe nicht verloren geht, jedoch benötigen sie einen magnetischen Halter.

Probenvorbereitung

Was sind die Probenanforderungen für ChIP-Seq?

Wie man Zellkerne für ChIP-Seq extrahiert?

Um ein Reißen der Kernmembran zu verhindern, können eine große Anzahl genomischer Fragmente verloren gehen. Um Kerne zu extrahieren, müssen wir auf die folgenden Aspekte achten: Erstens müssen wir ein geeignetes Puffersystem aufbauen, um das osmotische Druckgleichgewicht der Kernmembran aufrechtzuerhalten; zweitens müssen wir die Drehgeschwindigkeit während der Zentrifugation kontrollieren, um ein Reißen der Kernmembran zu verhindern; drittens müssen wir die Kerne mit fluoreszierenden Farbstoffen markieren, um die Integrität der Kerne nach der Extraktion zu überprüfen.

Was sind die Anforderungen an Tierzellproben für ChIP-Seq?

Die Anzahl der für ChIP verwendeten tierischen Zellen sollte vorzugsweise 10 betragen.⁷ oder mehr, andernfalls ist es schwierig, genügend DNA-Fragmente für den Bibliotheksaufbau anzureichern. Um Kerne mit weniger Verunreinigungen zu erhalten oder um Zellen in verschiedenen Zuständen zu trennen, ist eine Dichtegradientenzentrifugation erforderlich. Wenn die Kerne nach der Extraktion gelagert werden müssen, müssen sie schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert werden.

Muss ich die DNA-Proben für ChIP-Seq-Experimente elektrophoretisch trennen?

Die Elektrophorese ist notwendig, um (1) die Wirkung der Ultraschallfragmentierung zu testen. Die ChIP-Fragmentierung erfordert eine Größe zwischen 100 bp und 900 bp, was zu kurz ist, um die Integrität der Histon-/Transkriptionsfaktor-Bindungsregion zu gewährleisten, da dabei Teile der Informationen verloren gehen. Zu lang ist es, um nicht-zielgerichtete Regionen als falsch positiv zu enthalten; (2) die Integrität der genomischen DNA zu testen. Bei der Ultraschallfragmentierung sollte die Proben-DNA ein einzelnes Band intakter genomischer DNA aufweisen.

Welche Überlegungen gibt es für die ultrasonische Fragmentierung bei ChIP-Experimenten?

(1) Wählen Sie bei der Verwendung eines sonotropon-basierten Ultraschallfragmentierungsgeräts eine Sonde, die für Ihr Probenvolumen geeignet ist.
(2) In jedem Fall sollten die Scherparameter für Ihr Probenvolumen, die Zellendichte und den Zelltyp optimiert werden.
(3) Die Optimierung sollte die Leistungseinstellungen (Sonikationszeit vs. Intervallzeit/Pausenzeit) und die Anzahl der Scherzyklen umfassen, die erforderlich sind, um DNA-Fragmente mit einer Länge von 200-1000 bp zu erhalten, wobei jeweils nur ein Parameter pro Optimierungsexperiment optimiert wird.
(4) Achten Sie auf die Zeit- und Leistungseinstellungen. Übermäßige Fragmentierung und zu hohe Leistungseinstellungen können Epitoppe im Immunpräzipitationsschritt beschädigen.
(5) Halten Sie das Lysat immer eiskalt und sonifizieren Sie es intermittierend statt kontinuierlich, da die durch die Sonifikation erzeugte Wärme das Chromatin denaturieren kann.
(6) Vermeiden Sie Luftblasen während der Sonikationsfragmentierung. Blasen verursachen eine Oberflächenveränderung des Proteins und können zu einem Verlust von Chromatin in den Blasen führen. Um dies zu vermeiden, stellen Sie zunächst die Leistung auf ein niedrigeres Niveau ein und erhöhen Sie sie dann schrittweise.