ChIP-Seq Probenvorbereitungsprotokoll

Ernte von Material und Vernetzung

1. Tiergewebe: Übertragen Sie das frische oder schockgefrorene Gewebe (5–30 mg) in ein steriles 1,5 mL-Röhrchen und fügen Sie eine kleine Menge eisgekühltes PBS + Proteaseinhibitoren (250 μL bis 1,5 mL, wenn Sie mit 5 mg bzw. 30 mg Gewebe beginnen) hinzu, um das Gewebe mit einem Gewebehomogenisator zu zerkleinern. Lassen Sie das Volumen 1,2 mL nicht überschreiten; falls dies geschieht, teilen Sie die Probe auf zwei Röhrchen auf.
2. Vervollständigen Sie das Volumen des homogenisierten Gewebes mit eisgekühltem PBS + Proteaseinhibitoren (1–6 mL, proportional zur ursprünglichen Menge des Gewebes skalieren) und übertragen Sie es in ein eisgekühltes 15 mL Röhrchen.
3. Zellen in Suspension: Beginnen Sie mit 10⁷ Zellen (maximal 5 × 10)⁷ Zellen), die zentrifugiert werden, und setzen sie in 10 ml eisgekühltem PBS wieder in Suspension.
4. Adhärente Zellen: Trypsinieren und die Zellen sammeln (10⁷ Zellen, bis zu 5 × 10⁷ Zellen) durch Zentrifugation, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml eisgekühltes PBS hinzu.
5. Für die einfache Vernetzung: Fügen Sie Formaldehyd zu einer Endkonzentration von 1% hinzu und inkubieren Sie die Proben sofort unter sanfter Rotation für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie Glycin zu einer Endkonzentration von 150 mM hinzufügen und die Proben bei sanfter Rotation 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Für die doppelte Vernetzung: Fügen Sie EGS (Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat)) zu einer Endkonzentration von 1,5 mM hinzu und stellen Sie die Proben für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanfte Rotation.
8. Fügen Sie Formaldehyd zu einer Endkonzentration von 1% hinzu und inkubieren Sie bei sanfter Rotation für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
9. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie Glycin zu einer Endkonzentration von 150 mM hinzufügen und die Proben sanft rotierend 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Ernten Sie das Gewebe oder die Zellen durch Zentrifugation bei 2000×g für 10 Minuten bei 4 °C.
11. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein gleiches Volumen eisgekühltes PBS hinzu. Schütteln Sie das Röhrchen, bis das Zellpellet gelöst wird.
12. Ernten Sie das Gewebe oder die Zellen durch Zentrifugation bei 2000×g für 10 Minuten bei 4 °C. An diesem Punkt können die Proben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zu einem Monat bei -80 °C gelagert werden. Auftauen Sie Gewebeproben immer auf Eis (es kann einige Stunden dauern, wenn die Pellets groß sind).

Chromatin-Isolation und Sonikation

1. Resuspendieren Sie das Pellet in Zelllysepuffer. Für ein kleines Pellet (10⁷ Zellen oder 5 mg Gewebe erzeugen ein Pellet, das kleiner als 50 μL ist – verwenden Sie die Markierungen auf dem 1,5 mL Röhrchen als Referenz. Fügen Sie 1 mL Zelllysepuffer hinzu. Für größere Pellets fügen Sie 5 mL Zelllysepuffer hinzu und pipettieren auf und ab, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist.
2. 10 Minuten auf Eis inkubieren.
3. Beim Lyse von Geweben: Übertragen Sie die Gewebesuspension in einen 2 mL Dounce-Homogenisator (auf Eis gehalten) und vervollständigen Sie die Gewebedispersierung mit dem Kolben B (20 Schläge). Übertragen Sie den Lysat in ein frisches 1,5 mL oder 15 mL Röhrchen (je nach Volumen des in Schritt 6 verwendeten Zelllysepuffers). Spülen Sie den Homogenisator mit 50 μL Zelllysepuffer und kombinieren Sie beide Volumina.
4. Zentrifugieren Sie den Lysat bei 2000×g für 5 Minuten bei 4 °C.
5. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie die nukleare Lysepuffer hinzu. Für kleine Pelletmengen fügen Sie 500 μL Puffer hinzu, und für größere Pelletmengen bis zu 3 mL nuklearen Lysepuffer. Inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis.
6. Reservieren Sie ein Aliquot (10–15 μL) der Chromatinlösung und halten Sie es auf Eis. Dies wird als nicht-sonifiziertes Kontrollproben verwendet, um es mit dem sonifizierten Chromatin zu vergleichen und die Effizienz der Sonifikation zu überprüfen.
7. Sonizieren Sie Ihre Proben. Da die Sonikation von Zelltyp, Gewebekomposition und Sonikator-Modell abhängt, erfordert dieser Schritt eine Optimierung. Bei Verwendung eines Covaris E220 Sonikators mit 1 mL AFA-Faserröhrchen (bis zu 1,2 × 10⁷ Zellen), empfehlen wir die folgenden Einstellungen als Ausgangspunkt: (PIP = 75, Duty-Faktor = 2 %, CPB = 200, Zeit = 1 bis 5 Minuten).
8. Pipettiere zwei Aliquots (10–15 μL) der sonizierten Proben, eines zur Bestimmung der Effizienz der Sonikation und ein weiteres zur DNA-Quantifizierung. Halte die Proben auf Eis.
9. Zentrifugieren Sie die Proben bei 18.000×g für 10 Minuten bei 4 °C, um den Schmutz zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5 mL Röhrchen und halten Sie es auf Eis. An diesem Punkt kann die Chromatinprobe in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und bei -80 °C bis zu einem Monat gelagert werden. Tauchen Sie das Chromatin immer wie oben beschrieben auf Eis auf.
Fügen Sie 10 μg RNAse A zu allen reservierten Aliquots hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C.
Fügen Sie 20 μg Proteinase K zu allen reservierten Aliquots hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei 65 °C.
12. Kochen Sie die Aliquots 10 Minuten lang bei 95 °C, um die Quervernetzungen zu lösen, und lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen.
13. Um die Effizienz der DNA-Sonikierung zu überprüfen, analysieren Sie die DNA-Fragmentgröße auf einem 1%igen Agarosegel. Wenn Proben für NGS eingereicht werden, sollte die Fragmentgröße zwischen 200 und 500 bp liegen. Wenn die Analysemethode qPCR ist, sollten die Fragmente zwischen 500 und 1000 bp liegen.
14. Quantifizieren Sie den aliquoten Anteil, der für die DNA-Quantifizierung reserviert ist, unter Verwendung des QIAquick PCR-Reinigungskits. Die eluierten DNA-Proben können mit einem NanoDrop-Spektrophotometer quantifiziert werden.