cfDNA-Extraktions- und Qualitätskontrollprotokoll

Zirkulierende zellfreie DNA (cfDNA) ist fragmentierte extrazelluläre DNA, die aus apoptotischen und nekrotischen Zellen in kleinen Fragmenten von <200 bp freigesetzt wird. Zellfreie DNA wird typischerweise aus dem Blutstrom isoliert; es ist jedoch auch möglich, cfDNA in anderen biologischen Flüssigkeiten wie Urin oder Liquor cerebrospinalis nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass ctDNA von Krebspatienten genetische Informationen von Tumorzellen trägt. Daher hilft das Studium zirkulierender DNA, genomische Mutationen bei spezifischen Erkrankungen, wie verschiedenen Krebsarten, zu identifizieren. Sie kann in Zukunft für nicht-invasive Biopsien und die Überwachung von minimaler Resterkrankung (MRD) verwendet werden.

Probenvorbereitung

1. Zentrifugieren Sie Blutentnahmeröhrchen bei 2000 × g für 10 Minuten. Bei Verwendung von EDTA-Röhrchen sollte die Bearbeitungszeit 4 Stunden nach der Probenentnahme nicht überschreiten.
2. Bewegen Sie die Überstände (Plasma) vorsichtig in ein 5 ml Röhrchen mit konischem Boden, ohne die Leukozytenschicht zu beschädigen.
Zentrifugieren Sie das isolierte Plasma bei 16.000 × g, 4 °C für 10 Minuten.
4. Überführen Sie die Überstände in ein sauberes 5 ml Röhrchen. Fahren Sie sofort mit der cfDNA-Extraktion fort oder lagern Sie bei -80°C.
5. cfDNA sollte aus 4 ml gereinigtem Blutplasma extrahiert werden (stellen Sie die Proben auf 4 ml ein, indem Sie bei einem Volumen von weniger als 4 ml eine phosphate-pufferte Salzlösung hinzufügen).

cfDNA-Extraktion

1. Vor Beginn der Extraktion sollten die folgenden Schritte durchgeführt werden:
(a) Bringen Sie Proben und Puffer auf Raumtemperatur (18–25 °C).
(b) Erhitzen Sie ein Wasserbad oder einen Heizblock auf 60 °C zur Verwendung mit 50 ml Röhrchen.
(c) Erhitzen Sie einen Heizblock auf 56 °C zur Verwendung mit 2 ml Eppendorf-Röhrchen.
Pipettiere 400 μl Proteinase K in ein vorbeschriftetes 50 ml Röhrchen.
Fügen Sie 4 ml Plasma zu dem Röhrchen hinzu.
4. Fügen Sie 3,2 ml Puffer ACL zu dem Röhrchen hinzu. Gut durchmischen, indem Sie 30 Sekunden lang vortexen.
5. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 60 °C.
6. Fügen Sie 7,2 ml Puffer ACB hinzu und mischen Sie gut durch Vortexen für 15–30 Sekunden.
7. Inkubieren Sie die Mischung 5 Minuten auf Eis.
8. Setzen Sie einen 20 ml Schlauchverlängerung in die offene Säule ein. Stellen Sie sicher, dass die Schlauchverlängerung fest in die Säule eingesetzt ist, um ein Auslaufen der Probe zu vermeiden.
9. Gießen Sie die Mischung aus Schritt 6 vorsichtig in den Röhrenverlängerer. Stellen Sie die Vakuumpumpe so ein, dass ein Vakuum von -800 mbar bis -900 mbar erzeugt wird, bis alle Lysate durchgezogen sind (dauert bis zu 15 Minuten).
10. Lassen Sie den Druck auf 0 mbar ab, entsorgen Sie die Schlauchverlängerungen sorgfältig und lassen Sie die Säulen am VacConnector des QIAvac 24 Plus angeschlossen.
11. Fügen Sie 600 μl Waschpuffer ACW1 zur Säule hinzu. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein (-800 mbar bis -900 mbar), während der Deckel offen ist. Nachdem der gesamte Waschpuffer durch die Säule gezogen wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lassen Sie den Druck auf 0 mbar ab.
12. Fügen Sie 750 μl Waschpuffer ACW2 zur Säule hinzu. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein (-800 mbar bis -900 mbar), während der Deckel offen ist. Nachdem der gesamte Waschpuffer durch die Säule gezogen wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lassen Sie den Druck auf 0 mbar ab.
13. Fügen Sie 750 μl Ethanol (96–100%) zur Säule hinzu. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein (-800 mbar bis -900 mbar), während der Deckel offen ist. Nachdem das gesamte Waschpuffer durch die Säule gezogen wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lassen Sie den Druck auf 0 mbar ab.
14. Schließen Sie den Deckel der Säule. Entfernen Sie sie vom Vakuum-Manifold und entsorgen Sie den VacConnector. Bewegen Sie die Säule in ein sauberes 2 ml Sammlungsglas und zentrifugieren Sie sie bei voller Geschwindigkeit (16.000 × g) für 3 Minuten.
15. Bewegen Sie die QIAamp Mini-Säule in ein neues 2 ml Sammlungsglas, öffnen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei 56 °C für 10 Minuten, um die Membran vollständig zu trocknen.
16. Bewegen Sie die QIAamp Mini-Säule in ein sauberes 1,5 ml Elutionsröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig 20–150 μl Puffer AVE auf den Filter der QIAamp Mini-Säule. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 3 Minuten.
17. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 16.000 × g. Spülen Sie die Säulen weg.
18. Für die nachgelagerte Verarbeitung kann isolierte cfDNA bei 4 °C bis zu 24 Stunden gelagert werden. Für eine längere Lagerung bei <30 °C einfrieren.
19. Verwenden Sie einen Fragmentanalysator, um die extrahierte cfDNA genau zu messen und zu qualifizieren.
20. Nach der Extraktion sollte cfDNA bei -80 °C gelagert werden.

cfDNA-Qualitätskontrolle durch digitale Tropfen-PCR (ddPCR)

1. Bereiten Sie die Reaktionsmischung vor, indem Sie 10 μl 2× ddPCR Supermix, 0,3 μl Vorwärtsprimer (20 μM), 0,3 μl Rückwärtsprimer (20 μM) und 0,1 μl Sonde (20 μM) zu 1 μl DNA hinzufügen und mit ddH2O auf 20 μl auffüllen.
2. Erzeugen Sie die Tropfen, indem Sie 20 μl Probe in die Probenbrunnen pipettieren und 70 μl QX200 Tropfengenerierungsöl in den Ölbrunnen der DG8-Kartusche geben. Decken Sie diese mit den DG8-Dichtungen ab und platzieren Sie sie in den QX200 Tropfengenerator.
3. Übertragen Sie vorsichtig 40 μl der erzeugten Tropfen mit einer Mehrkanalpipette auf die Twin. tec PCR-Platte, indem Sie langsam pipettieren. Versiegeln Sie die Platte mit einer durchstechbaren Folienheißsiegelung und einem PX1™ PCR-Plattensiegelgerät.
4. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler durch, indem Sie die Probe 10 Minuten lang bei 95 °C zur Denaturierung inkubieren, gefolgt von 40 Zyklen mit 30 Sekunden Inkubation bei 94 °C zur initialen Denaturierung und 1 Minute Inkubation bei 60 °C zur Annealung. Wenden Sie einen abschließenden Erweiterungsschritt an, indem Sie 10 Minuten lang bei 98 °C inkubieren und die Probe bei 4 °C lagern.
5. Bewegen Sie die Platten zum QX200 Tropfenleser, um die amplifizierten Tropfen zu messen.
6. Um die amplifizierten Fragmente zu messen, starten Sie ein neues Experiment in der QuantaLife™ Software, passen Sie das Supermix auf ddPCR™ Supermix ohne dUTP für die gewünschten Wells an, benennen Sie die Ziele und wählen Sie die entsprechenden Kanäle aus, die in der Sonde verwendet werden (FAM, HEX, usw.).
7. Legen Sie die Platte in den Leser und führen Sie das Experiment durch, wählen Sie DyeSet: FAM oder FAM/HEX.
8. Speichern Sie die Analyse und laden Sie die exportierte Datei in die Quanta-Soft™ Pro-Software.
9. Stellen Sie den Schwellenwert in der 1D-Amplitude auf den positiven Bruch ein.
10. Exportieren Sie die Ergebnisse in Excel oder eine andere Tabellenkalkulationsanwendung.
11. Berechnen Sie den Mittelwert der Kopien/20 μl Reads und teilen Sie ihn durch 2, um die Kopienzahl/Zelle zu bestimmen.
12. Teilen Sie die Kopienzahl/Zelle durch 150, um die Konzentration (ng/μl) zu berechnen. Berechnen Sie die cfDNA-Konzentration pro 1 ml Plasma.
13. Für die Bibliotheksvorbereitung die Reagenzien bis zur Verwendung auf Eis halten.

Referenzen:

1. Pott C, Kotrova M, Darzentas N, et al. cfDNA-basierte NGS-IG-Analyse bei Lymphomen[M]//Immunogenetik. Humana, New York, NY, 2022: 101-117.
2. Bohers E, Viailly P J, Jardin F. cfDNA-Sequenzierung: Technologische Ansätze und bioinformatische Herausforderungen. Pharmaceuticals, 2021, 14(6): 596.