ATAC-Seq-Protokoll

Gewebeeinlagerung

Schnellgefrieren

1. Sammeln Sie das Gewebe in einem sterilen Kryovial.
2. Tauchen Sie das Kryovial mit dem Gewebe in flüssigen Stickstoff ein.
3. Lagern Sie das Fläschchen in einem Flüssigstickstofflagerbehälter oder in einem -80℃ Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.

OCT-Einbettung und Einfrieren

1. Bevor Sie das Gewebe einfrieren, richten Sie die Kryomodelle ein und beschriften Sie sie mit einem Marker.
2. Bewahren Sie das OCT bei Raumtemperatur auf.
3. Geben Sie mehrere Tropfen OCT in die Kunststoff-Kryomulde. Legen Sie das Gewebe darauf und achten Sie auf die richtige Ausrichtung zum Schneiden. Gießen Sie vorsichtig OCT auf das Gewebe und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, bis kein Gewebe mehr exponiert ist. Halten Sie die Kryomulde mit einer Pinzette aufrecht und führen Sie sie in flüssigen Stickstoff ein, bis der Block gefroren ist. Gewebeblöcke sollten bei -80℃ gelagert werden.

Gewebeschnitt

1. Für die histologische Analyse schneiden Sie einen 5–10 μm dicken Kryostat-Schnitt und montieren ihn auf einem Superfrost Plus Objektträger. Färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) für die histologische Untersuchung nach Standardmethoden. Das Gewebe kann bei Bedarf mit einem sterilen Skalpell makroskopisch präpariert werden.
2. Für die Isolierung von Zellkernen schneiden Sie 1–2 (50 μm) Schnitte und geben Sie diese in ein vorgekühltes 1,5 mL Röhrchen.
Fügen Sie 1 mL kaltes PBS (1×) hinzu, um das OCT zu entfernen.
4. Zentrifugieren Sie bei 1500 ×g für 1 Minute bei 4℃ und entsorgen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2, bis OCT vollständig eliminiert ist.

Gewebehomogenisierung und Zelllyse

1. Nach der Entfernung von OCT das Gewebeschnitt oder das schockgefrorene Gewebe in 300 μL kaltem Lysepuffer resuspendieren und das Gewebe mit Einweg-Pesteln in 1,5 mL Mikroröhrchen bis zur vollständigen Homogenisierung douncen.
2. Inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis.
Fügen Sie 1 mL Waschpuffer hinzu.
4. Lassen Sie das homogenisierte Gewebe durch einen 40 μm Zellfilter passieren. Der Durchfluss sollte die Zellkerne enthalten.
Zentrifugieren Sie die Kerne bei 800 ×g für 10 Minuten bei 4℃ und entfernen Sie das Überstand.
6. Waschen Sie die Kerne mit 300 μL Waschpuffer.
Wiederholen Sie die Schritte 5 und 6 insgesamt 2 Mal.
8. Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren Sie in 300 μL Waschpuffer.
9. Zählen und visualisieren Sie Zellkerne mit dem Countess® II FL automatischen Zellzähler, der mit DAPI-Reagenz gefärbt ist. Alternativ können Zellkerne mit einem Hämozytometer gezählt werden.
10. Wenn die Kernpräparation noch Rückstände enthält und nicht sauber genug ist, wiederholen Sie die Schritte 4–7.
11. An diesem Schritt sind die Kerne bereit, mit der Transposition für die Bulk- und sc-Analyse fortzufahren. Die Kerne können an diesem Punkt in 90% FBS/10% DMSO bei -80℃ oder in flüssigem Stickstoff für längere Zeit gelagert werden.

Bulk ATAC-Seq

1. Pelletieren Sie 5000–100.000 Zellkerne bei 800 ×g für 5 Minuten bei 4℃.
2. Aspirieren Sie das Überstand, ohne das Pellet zu stören.
3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL Transpositionsmix, indem Sie 6 Mal auf- und abpipettieren, und fügen Sie 2,5 μL Tn5-Transposase (100 nM Endkonzentration) hinzu.
4. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37℃ für 30 Minuten in einem Thermomixer mit 850 U/min.
5. Reinigen Sie mit einem Qiagen MinElute Kit und eluieren Sie die transponierte DNA in 12 μL Elutionspuffer.

DNA-Amplifikation

1. Amplifizieren Sie die transponierte DNA, indem Sie eine 50 μL Reaktion vorbereiten, die Folgendes enthält: 12 μL der transponierten DNA, 2 μL von 5 μM maßgeschneidertem Nextera PCR Primer 1, 2 μL von 5 μM maßgeschneidertem Nextera PCR Primer 2, 0,3 μL von 100× SYBR Green I, 25 μL von NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix und 8,7 μL von nukleasefreiem Wasser.
2. Führen Sie das folgende PCR-Programm aus: 1 Zyklus von 5 Minuten bei 72℃ und 30 Sekunden bei 98℃, gefolgt von N Zyklen von 10 Sekunden bei 98℃, 30 Sekunden bei 63℃ und 1 Minute bei 72℃.
3. Die Anzahl der Zyklen hängt von der Ausgangszahl der transponierten Kerne ab. Das zuvor beschriebene Protokoll (OMNI) empfiehlt die Durchführung einer initialen Reaktion mit 5 Zyklen, gefolgt von einer qPCR-Nebenreaktion, um die Amplifikationsreaktion zu überwachen und die Anzahl der hinzuzufügenden Zyklen zu schätzen. Um die erforderlichen Zyklen zur Amplifikation zu erleichtern: Fügen Sie 15 Zyklen hinzu, wenn Sie mit <10.000 Kernen beginnen; fügen Sie 13–14 Zyklen von 10.000–50.000 Kernen hinzu; fügen Sie 12–13 Zyklen für 50.000–100.000 Kernen hinzu.
4. Fahren Sie mit der Bibliothekssequenzierung, der ersten Analyse der Sequenzen und der Qualitätskontrolle (QC) fort.

Referenz:

1. Cejas P, Long H W. Hochauflösende ATAC-Seq-Analyse von gefrorenen klinischen Geweben[M]//Chromatin. Humana, New York, NY, 2022: 259-267.