Ein Überblick über SNP-Genotypisierungstechnologien

Ein einzelner Nukleotid-Polymorphismus (SNP) stellt eine Variation in einem einzelnen Nukleotid dar, die an einer bestimmten Stelle im Genom auftritt. SNPs sind die Hauptverursacher der DNA-Variationen zwischen Individuen, mit einer Häufigkeit von etwa eins von 1.000 bp. Es wird angenommen, dass SNPs für phänotypische Unterschiede verantwortlich sind und die Entwicklung und den Verlauf mehrerer Krankheiten beeinflussen, sowie die Reaktion auf eine Medikamentenbehandlung und/oder Umweltstress bestimmen. Darüber hinaus können SNPs als ideale molekulare Marker zur Identifizierung von Genen dienen, die mit wichtigen biologischen Merkmalen und Krankheiten assoziiert sind. Daher wird das SNP-Profiling als von großer Bedeutung in der selektiven Zucht, der landwirtschaftlichen Produktion und Produktivität, der personalisierten Medizin und der Medikamentenbehandlung angesehen.

Was ist SNP-Genotypisierung?

SNP-Genotypisierung bezieht sich auf die Bestimmung von SNP-Loci auf einer gesamten Genomskala oder innerhalb von genomischen Regionen von Interesse. Die Hauptanwendungen der SNP-Genotypisierung liegen in der Behandlung von Krankheiten und in pharmakogenomischen Studien. Eine Vielzahl von Technologien und kommerziellen Plattformen wurde für die SNP-Genotypisierung entwickelt. Je nach Forschungszweck kann die SNP-Genotypisierung in zwei Kategorien unterteilt werden: genomweite Assoziationsstudie (GWAS) und feine KartierungDie gängigen Ansätze zur SNP-Genotypisierung umfassen SNP-Mikroarray, TaqMan SNP-Genotypisierung, MassARRAY SNP-Genotypisierungund Hochdurchsatz-Sequenzierung. Mit der rasanten Entwicklung der SNP-Genotypisierungstechnologien wurden eine große Anzahl öffentlicher Datenbanken eingerichtet, um identifizierte SNPs zu sammeln (Tabelle 1).

Tabelle 1. SNP-Datenbanken.

1. SNP-Mikroarrays

Die kommerziell verfügbaren Arrays für SNP-Genotypisierung umfassen hauptsächlich die Affymetrix SNP- und Illumina-Plattformen. Die Prinzipien beider Plattformen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Genotypisierungslösungen von Affymetrix und Illumina bieten eine zuverlässige Leistung im Hinblick auf präzisionsmedizinische Anwendungen, landwirtschaftliche Genotypisierung, Forensik, bevölkerungsweite Studien und genomweite Assoziationsstudien (GWAS). Kommerziell erhältliche Hochdichte-SNP-Chips decken den Großteil des menschlichen Genoms sowie andere Pflanzen und Tiere von wirtschaftlicher Bedeutung ab. Alternativ ermöglichen semi-kundenspezifische und kundenspezifische Chips den Forschern, gewünschte Marker auszuwählen.

Abbildung 1. Übersicht über SNP-Array-Technologie (Laframboise 2009). (a) In den Affymetrix-Tests gibt es Sonden für beide Allele, und die DNA bindet an beide Sonden, unabhängig von dem Allel, das sie trägt. Die beeinträchtigte Bindung äußert sich in einem schwächeren Signal. (b) In Illumina-Beadarray-Tests enthält eine Perle eine Sequenz, die komplementär zu der Sequenz neben den SNP-Loci ist. Wenn sie an die DNA bindet, zeigt sie unterschiedliche Farben.

2. TaqMan SNP-Genotypisierung

TaqMan SNP-Genotypisierung bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit zur Analyse von SNP-Stellen. TaqMan SNP-Genotypisierungsassays umfassen mittlerweile mehr als 17 Millionen vorgefertigte Sammlungen für den Einsatz in Formaten von 48-, 96-, 384- und OpenArray-Realtime-PCR-Instrumenten. Jede vorgefertigte Sammlung enthält zwei allelspezifische TaqMan MGB-Sonden, die mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, sowie ein PCR-Primer-Paar. Sie passen einzigartig an die DNA an, um eine hohe Spezifität für das interessierende Allel zu bieten. Ein 5'-Reporterfarbstoff und ein 3'-Quencherfarbstoff sind kovalent an die Sonden gebunden. Wenn die Sonden intakt sind, wird die Fluoreszenz unterdrückt. Während der PCR-Verlängerung tritt die Exonuklease-Aktivität nur bei den perfekt passenden Sonden auf. Die Reporter- und Quencherfarbstoffe werden dann aufgrund der Exonuklease-Aktivität freigesetzt. Das fluoreszierende Signal wird gemessen, um den Genotyp der Probe zu bestimmen.

Abbildung 2. Das Prinzip der TaqMan SNP-Genotypisierung.

3. MassARRAY SNP-Genotypisierung

Die MassARRAY-Plattform bietet mehrere Vorteile für Benutzer, die einen genauen, maßgeschneiderten SNP-Genotypisierungsassay wünschen. Sie nutzt einen einzelnen Erweiterungsprimer, um alle allele-spezifischen Produkte für alle PCR-Stellen zu erzeugen, was eine einheitliche Terminierungsmixtur gewährleistet. Der Assay basiert auf der Primererweiterung und umfasst eine locus-spezifische Primererweiterungsreaktion und eine locus-spezifische Primererweiterungsreaktion (iPLEX-Assay). Im iPLEX-Assay annealiert ein Oligonukleotidprimer unmittelbar stromaufwärts der SNP-Stelle, die genotypisiert wird. Anschließend erfolgt die Primererweiterung, die eine einzelne komplementäre, massenmodifizierte Base ist. Die Masse der erweiterten Produkte wird mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestimmt. MassARRAY SNP-Genotypisierung kann mehrere SNP-Stellen in einer Reaktion analysieren. Diese Methode ist genau und hat einen Preisvorteil, wenn Dutzende oder Hunderte von SNPs analysiert werden.

Abbildung 3. Die Schritte der Genotypisierung mit dem MassARRAY iPLEX-System (Svidnicki et al. 2015). (a) Locus-spezifische Amplifikationsreaktion. (b) Die SAP-Enzym neutralisiert nicht inkorporierte dNTPs. (c) iPLEX-Assay. (d) Die Produkte werden mit der MALDI-TOF-Methode analysiert. (e) Datenanalyse.

4. SNP-Analyse durch Hochdurchsatz-Sequenzierung

Die Sequenzierung des menschlichen Genoms identifizierte über 3,1 Millionen validierte SNPs. Die entwickelten SNP-Datenbanken bieten wertvolle Informationen für das Design von Assoziationsstudien und die Dateninterpretation. Die Sequenzierung ist ein leistungsstarker und hochdurchsatzfähiger Ansatz für die SNP-Genotypisierung, und es wurden eine Reihe von Methoden entwickelt, die auf der Sequenzierung basieren, um SNP-Analysen durchzuführen, wie zum Beispiel Genotypisierung durch Sequenzierung (GBS)Die SNP-Analyse mittels Next-Generation-Sequencing (NGS) umfasst in der Regel die Erzeugung eines spezifischen DNA-Produkts aus ausgewählten genomischen Regionen, gefolgt von der direkten Sequenzierung. Mit den gesunkenen Kosten für Sequenzierungen werden Next-Generation-Sequencing (z. B. Illumina, Roche 454, Ion Torrent) und die dritte Generation der Sequenzierung (z. B. Nanopore, PacBio SMRT) zunehmend verfügbar.

Referenzen:

1. Svidnicki M C C C C M, Silva-Costa S M, Ramos P Z, u. a.Screening genetischer Veränderungen im Zusammenhang mit nicht-syndromischem Hörverlust unter Verwendung der MassARRAY iPLEX®-Technologie. BMC medizinische Genetik, 2015, 16(1): 85.
2. Gabriel S, Ziaugra L, Tabbaa D. SNP-Genotypisierung mit der Sequenom MassARRAY iPLEX-Plattform. Aktuelle Protokolle in der Humangenetik, 2009, 60(1): 2.12. 1-2.12. 18.
3. Komar A A. Einzelne Nukleotid-Polymorphismen. Methoden in der Molekularbiologie, 2009, 578.