Was ist Zyklus-Sequenzierung?

Im Bereich der genetischen Analyse stellt das Zyklus-Sequenzieren einen Höhepunkt an Präzision und Effizienz dar und bietet Forschern ein leistungsstarkes Instrument zur Entschlüsselung der Komplexität, die in der DNA eingebettet ist. Abgeleitet als Verbesserung der herkömmlichen Sanger-Sequenzierung hat sich das Zyklus-Sequenzieren in der Landschaft der genetischen Sequenzierung verwandelt und ermöglicht eine umfassende Analyse, die durch beispiellose Präzision und Schnelligkeit gekennzeichnet ist. In diesem Diskurs begeben wir uns auf eine umfassende Erkundung des Zyklus-Sequenzierens, erläutern seine grundlegenden Prinzipien, prozeduralen Nuancen und seine zahlreichen Anwendungen im Bereich der genetischen Untersuchung.

Verstehen von Zyklus-Sequenzierung: Ein näherer Blick auf die grundlegenden Prinzipien

Die Zyklus-Sequenzierung verkörpert eine nuancierte Fusion von Methoden der Molekularbiologie und harmonisiert Aspekte der klassischen Sanger-Sequenzierung mit der Effizienz, die in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) innewohnt. Im Kern zielt die Zyklus-Sequenzierung darauf ab, den genetischen Bauplan, der in DNA-Molekülen eingeschlossen ist, mit einer unvergleichlichen Präzision und Treue zu erhellen.

Prinzip der Kettenbeendigung

Im Zentrum der Zyklus-Sequenzierung steht das entscheidende Prinzip der Kettenbeendigung, ein grundlegender Aspekt des Sanger-Sequenzierungsparadigmas. Innerhalb dieses Rahmens wird die DNA-Synthese an präzisen Stellen entlang der DNA-Vorlage durch die Integration von Dideoxynukleotiden (ddNTPs) unterbrochen. Da diese ddNTPs keine 3'-OH-Gruppe besitzen, hemmen sie die nachfolgende Addition von Nukleotiden durch das DNA-Polymerase-Enzym und führen somit zur Beendigung der DNA-Synthese.

Integration der PCR-Zyklen

Das charakteristische Merkmal, das die Zyklus-Sequenzierung von ihrem traditionellen Pendant, der Sanger-Sequenzierung, unterscheidet, ist die Einbeziehung von PCR-ähnlichem Zyklisieren. Im Gegensatz zur linearen Trajektorie der DNA-Synthese, die bei der Sanger-Sequenzierung beobachtet wird, nutzt die Zyklus-Sequenzierung das thermische Zyklisieren innerhalb eines Thermocyclers, um iterative Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung von DNA-Fragmenten zu orchestrieren. Diese zyklische Methode steigert die Effizienz und Widerstandsfähigkeit der Sequenzierungsreaktion und ermöglicht so den Erwerb von Sequenzierungsdaten selbst aus geringen Mengen an Template-DNA.

Nutzung von thermo-stabilem DNA-Polymerase

Im Mittelpunkt des Zyklussequenzierens steht ein entscheidender Faktor: der Einsatz einer thermo-stabilen DNA-Polymerase, exemplifiziert durch Taq-Polymerase. Diese enzymatische Einheit zeigt eine außergewöhnliche Widerstandsfähigkeit bei erhöhten Temperaturen, wodurch die wiederholten Denaturierungs- und Synthesezyklen, die dem Zyklussequenzieren zugrunde liegen, erleichtert werden. Darüber hinaus verringert die thermo-stabile Eigenschaft der DNA-Polymerase die Wahrscheinlichkeit einer Enzymdenaturierung und schützt somit die Genauigkeit der DNA-Synthese während des gesamten Sequenzierungsprozesses.

Kennzeichnung von Sequenzierungsprimern

Ein weiterer entscheidender Aspekt der Zyklussequenzierung betrifft die Kennzeichnung der Sequenzierungsprimer, die wesentlichen Elemente, die die DNA-Synthese initiieren. Üblicherweise werden diese Primer mit entweder fluoreszierenden Farbstoffen oder radioaktiven Isotopen markiert, um die Visualisierung und Detektion der synthetisierten DNA-Fragmente zu erleichtern. Durch die Integration von markierten Primern in das Sequenzierungsumfeld können Forscher die Nukleotidsequenz, die in der DNA-Vorlage eingebettet ist, sorgfältig entschlüsseln.

Fragmenttrennung und -analyse

Nach dem Abschluss des Zyklus-Sequenzierungsverfahrens werden die synthetisierten DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe segregiert, wobei entweder die Kapillarelektrophorese oder die Gelelektrophorese zum Einsatz kommt. Anschließend werden die fluoreszenzmarkierten Fragmente identifiziert und analysiert, wobei jedes fluoreszente Signal einem bestimmten Nukleotid entspricht, das während der DNA-Synthese aufgenommen wurde. Mithilfe komplexer Datenanalysealgorithmen übernehmen die Forscher die anspruchsvolle Aufgabe, die DNA-Sequenz zu entschlüsseln, indem sie die sequenzielle Anordnung der erfassten fluoreszenten Signale ableiten.

Abbildung 1 Übersicht über die Zyklus-Sequenzierungsreaktion. Doppel- oder einzelsträngige Matrizen durchlaufen eine dreistufige Temperaturzyklusreaktion, die aus Hochtemperatur-Denaturierung, Primer-Annealing und Primer-Verlängerung/-Beendigung besteht (Keith Kretz et al., 2024)

Zyklus-Sequenzierung vs. PCR

Sowohl die Zyklus-Sequenzierung als auch die PCR sind molekularbiologische Techniken, die in der DNA-Analyse eingesetzt werden, jedoch dienen sie unterschiedlichen Zwecken und verwenden unterschiedliche Methoden. Die PCR dient hauptsächlich dazu, spezifische DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wodurch die Erzeugung zahlreicher Kopien eines gezielten DNA-Bereichs erleichtert wird. Im Gegensatz dazu zielt die Zyklus-Sequenzierung darauf ab, die Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments zu ermitteln.

Zyklus-Sequenzierung vs. Sanger-Sequenzierung

Zyklussequenzierung und Sanger-Sequenzierung, während beide zum Bereich der DNA-Sequenzierung Methoden weisen Unterschiede in ihren Methoden und Ansätzen auf. Das Sanger-Sequenzieren, das in den 1970er Jahren von Frederick Sanger entwickelt wurde, stellt die konventionelle Methode der DNA-Sequenzierung dar, während das Zyklus-Sequenzieren als eine weiterentwickelte Variante dieser Technik hervorgeht, die darauf abzielt, Effizienz und Durchsatz zu steigern.

Die Schritte der Zyklus-Sequenzierung

Zyklus-Sequenzierung, eine Erweiterung der klassischen Sanger-Sequenzierung Methode, umfasst eine Reihe von entscheidenden Verfahren, die auf die präzise Amplifikation und Sequenzierung von DNA-Fragmenten abzielen.

1. Primerbeschriftung und Vorbereitung

Der erste Schritt umfasst das Labeln von Sequenzierungsprimern, die sorgfältig entworfen wurden, um an die Ziel-DNA-Sequenz zu binden und somit die DNA-Synthese einzuleiten. Bei der Zyklussequenzierung sind die Primer mit entweder einem fluoreszierenden Farbstoff oder einem radioaktiven Label versehen, was die anschließende Detektion erleichtert. Diese markierten Primer werden sorgfältig vorbereitet, indem sie an die einzelsträngige Template-DNA annealed werden, gleichzeitig in Anwesenheit eines DNA-Polymerase-Enzyms und einer Mischung von Desoxynukleotiden (dNTPs).

2. Thermisches Radfahren

Nach der Primer-Annealing-Phase innerhalb der Template-DNA wird das Reaktionsgemisch einem Prozess unterzogen, der als thermisches Zyklen bekannt ist. Dieser entscheidende Prozess umfasst eine geregelte Reihe von Temperaturoszillationen, die darauf abzielen, die Denaturierung der DNA zu beschleunigen, das Annealing der Primer zu erleichtern und die DNA-Synthese anzuregen.

Typischerweise wird das Reaktionsgemisch zunächst einer erhöhten thermischen Bedingung ausgesetzt, die die DNA-Denaturierung begünstigt. Dieser gezielte Temperaturanstieg führt zur Trennung der doppelsträngigen DNA in einzelne Stränge. Anschließend wird eine Temperaturabsenkung eingeleitet, die die Primer-Annealing-Phase fördert. In diesem letzten Schritt binden die Primer selektiv an ihre jeweiligen komplementären Sequenzen, die im Template-DNA vorhanden sind.

Schließlich wird ein intermediäres Temperaturregime eingesetzt, um den DNA-Syntheseprozess zu initiieren und zu fördern. Während dieser Phase verlängert die enzymatische Maschinerie, die durch die DNA-Polymerase repräsentiert wird, substantiell den Primer. Dieser Verlängerungsprozess wird durch die inhärente Fähigkeit der Polymerase erreicht, komplementäre Nukleotide sequenziell in den Matrizenstrang einzufügen und somit die ordnungsgemäße architektonische Anordnung des neuen DNA-Moleküls zu leiten.

3. Einbau von kettenabbrechenden Nukleotiden

Mit Beginn der DNA-Synthesephase werden eine Art von Nukleotiden, bekannt als Dideoxynukleotide (ddNTPs), die als kettenabbrechende Nukleotide bezeichnet werden, in den sich entwickelnden DNA-Filament integriert. Diese speziellen ddNTPs sind frei von einer 3'-OH-Gruppe, was eine anschließende Fortsetzung der DNA-Synthese nach ihrer Hinzufügung zum wachsenden Strang ausschließt. Folglich führt dies zur Beendigung der DNA-Synthese an jedem jeweiligen ddNTP-Standort, was in der Produktion einer Reihe von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Längen resultiert.

4. Trennung und Detektion

Nach dem Abschluss der thermozyklischen Reaktionen werden die erzeugten DNA-Fragmente entsprechend ihrer jeweiligen Größen durch Verfahren wie Gel-Elektrophorese oder Kapillarelektrophorese unterschieden. Nach der Trennung unterliegen diese Fragmente der Detektion und anschließenden Visualisierung, entweder durch Fluoreszenzdetektion, sofern die Primer ein fluoreszierendes Label tragen, oder mittels Autoradiographie, wenn die Primer radioaktiv markiert sind. Die resultierenden Sequenzdaten können dann analysiert werden, um die Nukleotidsequenz der ursprünglichen DNA-Vorlage zu bestimmen.

Durch die Einhaltung dieser Verfahrensschritte ermöglicht das Zyklus-Sequenzieren die präzise und effiziente Sequenzierung von DNA-Fragmenten. Dies macht es zu einem unschätzbaren technologischen Werkzeug für die molekularbiologische Forschung, diagnostische Praktiken und eine Vielzahl anderer wissenschaftlicher Disziplinen.

Zyklus-Sequenzierungsprotokoll: Ein detailliertes Verfahren

Materialien und Ausrüstung

Bevor Sie das Protokoll zur Zyklussequenzierung starten, sammeln Sie alle notwendigen Materialien und Geräte:

Materialien:

Beschriftungspuffer: 300 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM MgCl2, 1 M KCl.

Kinase-Dilutionspuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM DTT, 0,1 mM ATP, 0,2 mg/mL BSA, 50% Glycerin.

Sequenzierungsprimer: Kommerziell erhältlich, z.B. 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'.

Markiertes Adenosintriphosphat: [γ-32P]ATP (≥ 3000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) oder [γ-33P]ATP (1600 Ci/mmol).

Sequenzierungspuffer: 300 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM MgCl2, 300 mM KCl, 0,5% W-1.

Formamid-Färbelösung: 95% deionisiertes Formamid, 10 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylencyanols.

Taq-DNA-Polymerase, dNTPs und ddNTPs: Handelsüblich erhältlich.

10X TE-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA.

Leichte Silikonöl: Optional.

PCR-Primer mit universellen Tails: z.B. M13 vorwärts (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') und M13 rückwärts (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3').

Ausrüstung:

Thermocycler: In der Lage, PCR-ähnliche thermische Zyklen auszuführen.

Wasserbäder oder Heizblöcke: Zur Aufrechterhaltung spezifischer Temperaturen.

Mikrozentrifugenröhrchen: Polypropylen, 0,2 oder 0,5 ml.

Automatische Pipetten: In der Lage, 0,5–20 µL und 10–100 µL abzugeben.

Elektrophoresegeräte: Für DNA-Sequenzierung.

Röntgenfilm: Einseitig mit blauer Basis.

Verfahren

Schritt 1: Primer-Markierung

Verdünnen Sie den Sequenzierungsprimer auf 0,5 pmol/µL mit 1X TE-Puffer.

Mischen Sie 2 µL des verdünnten Primers, 1 µL des Labeling-Puffers, 2 pmol des markierten ATP und 1 µL der T4-Polynukleotidkinase in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten bei 37°C, gefolgt von 5 Minuten bei 55°C.

Legen Sie das Röhrchen auf nasses Eis, um die Reaktion zu beenden.

Schritt 2: Vorbereitung der Reaktionsmischungen

Bereiten Sie ein Prereaktionsgemisch vor, indem Sie 5 µL des markierten Primers, 4,5 µL des Sequenzierungspuffers, 7–26 µL der Template-DNA, 0,5 µL Taq-DNA-Polymerase und autoklaviertes destilliertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 36 µL bringen.

Teilen Sie das Prereaktionsgemisch in vier Mikrozentrifugenröhrchen auf, die mit A, C, G und T beschriftet sind.

Schritt 3: Reaktionen sequenzieren

Bereiten Sie die Sequenzierungsmischungen gemäß Tabelle 1 vor.

Fügen Sie 10 µL des entsprechenden Sequenzierungsmixes zu jedem beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.

Sichern Sie die Röhren mit Kappen und mischen Sie vorsichtig.

Wenn Sie einen Thermocycler ohne beheizten Deckel verwenden, fügen Sie jeder Reaktion 20 µL Silikonöl hinzu.

Starten Sie den thermischen Zyklus mit folgendem Programm:

3 Minuten bei 95°C zur Denaturierung.

20 Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Annealing bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 70 °C für 60 s.

10 zusätzliche Zyklen der Denaturierung bei 95 °C für 30 s und der Verlängerung bei 70 °C für 60 s.

Schritt 4: Analyse

Beenden Sie die Reaktionen, indem Sie 5 µL der Formamid-Färbelösung zu jedem Reagenzglas hinzufügen.

Gut mischen und kurz zentrifugieren.

Lag die Reaktionsröhrchen bis zur Analyse bei -20 °C.

Trennen Sie die Reaktionsprodukte auf einem Sequenzierungsgel und visualisieren Sie diese mit Röntgenfilm.

Anwendungen der Zyklussequenzierung

Forschung zu genetischen Erkrankungen

Die Zyklussequenzierung ist entscheidend in der Forschung zu genetischen Erkrankungen, da sie die präzise Bestimmung von DNA-Sequenzen ermöglicht, die mit erblichen Störungen verbunden sind. Zum Beispiel verwendeten Ng et al. (2010) die Zyklussequenzierung, um neuartige Mutationen im PANK2-Gen zu entdecken, das mit der pantothenatkinase-assoziierten Neurodegeneration (PKAN), einer seltenen neurodegenerativen Erkrankung, in Verbindung steht. Durch die Sequenzierung der kodierenden Segmente des PANK2-Gens bei betroffenen Probanden identifizierten die Forscher Missense-Mutationen, die die Funktionalität des Proteins beeinträchtigten, und verbesserten somit das Verständnis der genetischen Grundlagen von PKAN (Ng et al., 2010).

Umweltmikrobiologie

Im Bereich der Umweltmikrobiologie dient das Zyklussequenzieren als grundlegende Methode zur Abgrenzung mikrobieller Gemeinschaften und ihres Repertoires an funktionellen Genen innerhalb verschiedener Ökosysteme. Beispielsweise nutzten Liu et al. (2018) das Zyklussequenzieren von 16S rRNA-Genen, um die mikrobielle Vielfalt und Zusammensetzung in Bodenproben aus verschiedenen Landnutzungskategorien zu untersuchen. Durch die Sequenzierung von PCR-amplifizierten Fragmenten der 16S rRNA-Gene erkannten die Forscher Veränderungen in der Architektur der mikrobiellen Gemeinschaften über verschiedene Landnutzungsmuster hinweg, wodurch die Auswirkungen von Landbewirtschaftungspraktiken auf die mikrobiellen Assemblagen im Boden verdeutlicht wurden (Liu et al., 2018).

Krebsgenomik

Die Technik des Zyklus-Sequenzierens findet Anwendung im umfangreichen Bereich der Krebsgenomik, wo sie eingesetzt wird, um somatische Mutationen und damit verbundene genomische Veränderungen aufzudecken, die für die Tumorentstehung und den anschließenden Verlauf entscheidend sind. Dies wird eindrucksvoll in der wegweisenden Studie von Imielinski et al. (2012) hervorgehoben, in der die koordinierte Anwendung des Zyklus-Sequenzierens das mutationale Panorama des Lungenadenokarzinoms enthüllte. Durch eine systematische Sequenzierung von Tumor- und entsprechenden normalen DNA-Proben gelang es den Forschern, wiederkehrende Mutationen in bestimmten Genen, nämlich EGFR, KRAS und TP53, erfolgreich zu identifizieren. Diese Enthüllung lieferte wichtige Hinweise auf die molekularen Mechanismen, die die Pathogenese von Lungenkrebs beeinflussen (Imielinski et al., 2012).

Forensische Analyse

In der forensischen Wissenschaft ist das Zyklus-Sequenzieren eine grundlegende Technik für die DNA-Profilierung und forensische Analysen, die es ermöglicht, Individuen durch ihre genetischen Signaturen zu identifizieren. Zum Beispiel nutzten Budowle et al. (2003) das Zyklus-Sequenzieren, um kurze tandemwiederholte (STR) Loci für die forensische DNA-Profilierung zu untersuchen. Durch das Sequenzieren von PCR-amplifizierten Fragmenten von STRs, die sowohl aus Beweismitteln am Tatort als auch aus Referenzproben extrahiert wurden, gelang es den Forschern, DNA-Profile erfolgreich abzugleichen, was erheblich zu kriminalistischen Ermittlungen und der Rechtsprechung beitrug (Budowle et al., 2003).

Die Nützlichkeit der Zyklus-Sequenzierung erstreckt sich über verschiedene Bereiche und umfasst ein Spektrum biologischer Forschungsanstrengungen und praktischer Anwendungen. Von der Entschlüsselung der genetischen Grundlagen von Krankheiten bis hin zur Abgrenzung mikrobieller Gemeinschaften und der Profilierung forensischer DNA erweist sich die Zyklus-Sequenzierung als vielseitiges Instrument zur Erzeugung präziser DNA-Sequenzinformationen. Ihre vielfältigen Anwendungen tragen erheblich zum Fortschritt des Wissens in den Bereichen Genetik, Mikrobiologie, Onkologie und Forensik bei und bereichern damit unser Verständnis dieser komplexen wissenschaftlichen Bereiche.

Erweiterung des Dienstleistungsangebots: Integration von Sanger- und Next-Generation-Sequenzierung

Bei der Untersuchung der Feinheiten des Beitrags der Zyklus-Sequenzierung zur genetischen Analyse ist es wichtig, ihre Bedeutung im Kontext der Sequenzierungsmethoden zu betrachten. Obwohl die Zyklus-Sequenzierung als grundlegende Methode dient, die eine sorgfältige und zügige DNA-Analyse bietet, wird ihre Wirksamkeit durch die Funktionen, die sowohl in der Zyklus-Sequenzierung als auch in anderen Methoden verankert sind, verstärkt und harmonisiert. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung (NGS).

Sanger-Sequenzierung: Eine Grundlage der Präzision

Sanger-Sequenzierung, das auf die Pionierarbeit von Frederick Sanger zurückgeht, bleibt die quintessentiale Methode in DNA-Sequenzierung aufgrund seiner sorgfältigen Erläuterung von Nukleotidsequenzen. Durch den strategischen Abbruch der DNA-Synthese unter Verwendung von kettenabbrechenden ddNTPs ermöglicht die Sanger-Sequenzierung Forschern, genetische Sequenzen mit unvergleichlicher Präzision zu erkennen. Ihre fokussierte Methodik erweist sich insbesondere als vorteilhaft bei der Validierung genetischer Varianten und der Sequenzierung bestimmter Regionen mit höchster Genauigkeit.

Nächste Generation Sequenzierung: Revolutionierung der genetischen Analyse

An der Spitze der Hochdurchsatz-Genomik, NGS Technologien haben unsere Methodik in der genetischen Analyse revolutioniert. Durch die Parallelisierung von Sequenzierungsreaktionen und die Nutzung bahnbrechender Plattformen ermöglicht NGS eine schnelle und umfassende genomische Aufklärung in einem Ausmaß, das mit herkömmlichen Sequenzierungstechniken zuvor unvorstellbar war. Von der gesamten Genomsequenzierung bis hin zu Metagenomik und Transkriptomik versetzt NGS Forscher in die Lage, die Feinheiten des Genoms mit beispielloser Tiefe und Reichweite zu erkunden.

Integration in Serviceangebote

Im Einklang mit unserem Engagement für gründliche Untersuchungen durch Zyklussequenzierung erweitert unser Institut nun seinen Umfang, um Sanger-Sequenzierung und NGSDiese ganzheitliche Strategie gewährleistet Forschern den Zugang zu einem vielfältigen Repertoire an Sequenzierungsmethoden, die jeweils mit einzigartigen Fähigkeiten und Nutzen ausgestattet sind. Ob es darum geht, die genetischen Grundlagen von Krankheiten zu entschlüsseln, mikrobielle Populationen zu charakterisieren oder forensische DNA zu profilieren, unser erweitertes Dienstleistungsportfolio stattet Forscher mit den erforderlichen Werkzeugen und Fachkenntnissen aus, um die Komplexität der genetischen Analyse geschickt zu bewältigen.

Referenzen:

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