Richtlinien zur Einreichung von Proben
Degradom-Sequenzierung Q&A
Allgemeine Fragen
- Gibt es Arten, für die die Degradom-Sequenzierung anwendbar ist?
- Im Gegensatz zu Tieren durchlaufen pflanzliche miRNAs in der Regel eine vollständige oder nahezu vollständige Paarung mit Zielgenen, um das Shearing der Zielgene zu verursachen und somit die Genexpression zu regulieren, wodurch es weniger falsch-positive Ergebnisse und genauere Identifikationsergebnisse gibt. Im Vergleich zu Tieren sind Pflanzen besser geeignet, um miRNA-Zielgene mithilfe von Degradom-Sequenzierung zu untersuchen. Im Gegensatz dazu sind Modellorganismen oder Arten mit detaillierten Transkriptominformationen besser geeignet für die Untersuchung von miRNA-Zielgenen mittels Degradom-Sequenzierung als Arten mit unvollständigen Transkriptominformationen.
- Was ist das minimale Anfangsvolumen für Proben zur Degradom-Sequenzierung?
- Das empfohlene Ausgangsvolumen für Degradom-Sequenzierung beträgt > 20 μg Gesamt-RNA. Für Pflanzengewebe wird 1 g oder mehr frisches Gewebe empfohlen (es gibt einige Unterschiede zwischen verschiedenen Gewebestellen).
- Wie viel Datenvolumen sollte für Degradom-Sequenzierung sequenziert werden?
- Im Allgemeinen sind 10 Millionen Reads für herkömmliche Arten ausreichend. Für Arten mit großen und komplexen Genomen kann die Menge an Sequenzierungsdaten verdoppelt werden.
- Wie viele biologische Replikate sind für die Degradom-Sequenzierung erforderlich?
- Biologische Replikate sollten mit der Anzahl der miRNAs konsistent sein (≥3), und in besonderen Fällen kann in Betracht gezogen werden, die Proben innerhalb der Gruppe zu mischen und das Datenvolumen zu erhöhen.
- Was kann Degradom-Sequenzierung zusätzlich zur Erkennung der Zielgene von miRNAs tun?
- Zunächst müssen wir verstehen, dass eine der größten Rollen der Degradom-Sequenzierung darin besteht, die Zielgene von miRNAs zu finden. Aber natürlich stellen die Forscher, die die Degradom-Daten eingehend analysieren, fest, dass sie auch verwendet werden kann, um die Selbstregulation von miRNAs, ta-siRNA, phasiRNA, die Verarbeitung von Vorläufersequenzen und zur Entdeckung neuer miRNAs zu untersuchen.
- Welche Sequenzierungsplattformen und Lese-längen werden für die Degradome-Sequenzierung verwendet?
- Sowohl Illumina als auch MGI sind derzeit als gängige Plattformen für die Sequenzierung der zweiten Generation verfügbar. Aufgrund der kurzen Zielfragmente wird die SE50-Sequenzierungsstrategie verwendet.
- Was ist der Unterschied zwischen Degradom-Sequenzierung und RACE-Validierung?
- Obwohl die Vorhersage von Rohsignalen die Zielgene von miRNAs mit hoher Durchsatzrate vorhersagen kann, gibt es viele falsch-positive Ergebnisse, und die Resultate sind nicht zuverlässig. Die RACE-Validierung ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv und hat nicht die gleiche hohe Durchsatzrate wie die Vorhersage von Rohsignalen. Daher besteht der Vorteil der Degradom-Sequenzierung darin, dass nicht nur die Zielgene von miRNAs in hoher Durchsatzrate nachgewiesen werden können, sondern auch die Ergebnisse durch biologische Experimente gewonnen werden, was die Glaubwürdigkeit der experimentellen Ergebnisse erheblich verbessert.
- Was ist die genaue Bedeutung des Alignment-Scores im Ergebnis?
- Der Alignmentscore ist ein Wert zur Vorhersage von Zielgenen, indem Targetfinder auf die cDNA-Bibliothek und die kleine RNA-Bibliothek der sequenzierten Spezies angewendet wird. miRNA und mRNA werden verglichen und als komplementäre Paarungen bewertet (1 Punkt für eine Fehlpaarung oder Löschung, 0,5 Punkte für eine G:U-Paarung, doppelter Punktwert für Fehlpaarungen und G:U-Paarungen im Kernbereich, beginnend vom 2. nt bis zum 13. nt der microRNA). Der Alignmentscore wird als Grad der Übereinstimmung zwischen Zielgen und miRNA definiert; je niedriger der Score, desto vollständiger ist die Übereinstimmung und desto zuverlässiger ist sie.
- Was ist die spezifische Bedeutung von Kategorie im Ergebnis?
- Die Bedeutung der Kategorietypisierung besteht darin, die Anzahl der degradierten Fragmente zu visualisieren, die durch miRNA-Schnitte von mRNA erzeugt werden, und das Vertrauensniveau ist Kategorie 0>1>2>3>4.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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