Richtlinien zur Einreichung von Proben
Bulk-Segregant-Analyse Q&A
Allgemeine Fragen
- Wie funktioniert Ihr BSA-Analyse-Service?
- In BSA (Bulked Segregant Analyse)In einer segregierenden Population werden Individuen nach dem Phänotyp des Zielmerkmals gruppiert und gemischt, und die Individuen oder Stämme in der Population werden in zwei Gruppen unterteilt, basierend auf den relativen Unterschieden des Zielmerkmals. Anschließend wird die DNA der Individuen oder Stämme in den beiden Gruppen separat gemischt, um einen relativen DNA-Mischpool zu bilden. Die Eltern- und Nachkommenpools werden sequenziert, SNPs werden detektiert, und die Indexwerte der Nachkommenpools werden basierend auf den Loci mit reinen Unterschieden zwischen den Eltern berechnet, wobei die Loci mit größeren Unterschieden ausgewählt werden.
- Welche Art von Eltern eignet sich für den Bevölkerungsaufbau?
- Es wird empfohlen, Eltern mit einzelnen Merkmalsunterschieden und möglichst wenigen heterozygoten Loci auszuwählen, und es wird auch empfohlen, dass die Unterschiede zwischen den Eltern nicht zu groß sein sollten, da zu große Unterschiede zwischen den Eltern zu erheblichen falsch positiven Ergebnissen führen und es einfach machen, die falsch positive Region zu lokalisieren; wenn man zwei direkt verwandte Sorten auswählt, ist es einfach, die Kandidatenregion zu lokalisieren, da die Unterschiede zwischen den Eltern zu klein sind; für die Eltern des Zielmerkmals gibt es verschiedene Möglichkeiten, die Eltern zu erhalten. Für die Eltern des Zielmerkmals gibt es verschiedene Methoden, um die Kandidatengene zu erhalten, wie EMS-Mutagenese, natürliche Individuen, UV-Mutagenese, die alle verwendet werden können, um die Kandidatengene zu lokalisieren. BSA.
- Wie wählt man eine Population für BSA aus?
- Gemäß dem Prozess der Populationsbildung werden Populationstypen normalerweise in natürliche und Familienpopulationen unterteilt. BSA Die Trait-Lokalisierung wird angewendet, um den Haupteffekt eines einzelnen Merkmals in einer Familienpopulation zu bestimmen.
Die Quelle der Eltern ist wichtig und es gibt verschiedene Methoden, um Eltern für die Zielmerkmale zu erhalten, wie z.B. EMS-Mutagenese, natürliche Individuen, UV-Mutagenese, T-DNA-Einfügung usw.
- Gemäß dem Prozess der Populationsbildung werden Populationstypen normalerweise in natürliche und Familienpopulationen unterteilt. BSA Die Trait-Lokalisierung wird angewendet, um den Haupteffekt eines einzelnen Merkmals in einer Familienpopulation zu bestimmen.
- Wie man eine Familienpopulation für BSA aufbaut?
- Es gibt viele Möglichkeiten, die Familienpopulation zu konstruieren, darunter sind F2, BC und RIL die gängigen Populationen, die für BSA verwendet werden können. Die konventionelle F1-Generation kann nicht für die Lokalisierung von BSA-Eigenschaften verwendet werden, da es keine Merkmalssegregation gibt. DH kann ebenfalls für die Lokalisierung von BSA-Eigenschaften verwendet werden, ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten bei der Konstruktion nicht verbreitet.
- Ist es möglich, nur die Eltern zu testen? Oder nur den Nachkommenpool? Oder nur einen Nachkommenpool?
- (1) Wenn das untersuchte Merkmal eine durch EMS induzierte Mutationsmerkmale ist, können nur zwei subgenerationalen Pools (Wildtyp + Mutant) getestet werden, oder ein Elternteil (Wildtyp) und ein subgenerationaler Pool (Mutant) können getestet werden;
(2) Wenn das untersuchte Merkmal ein quantitatives Merkmal ist, wird empfohlen, zwei Eltern und zwei subgenerationalen Pools zu messen. Der Einfluss der Anzahl der Proben auf die Analyseergebnisse wurde durch das aktuelle Online-Projekt bewertet, bei dem die besten Ergebnisse mit vier Proben erzielt wurden (d.h. zwei Eltern + zwei subgenerationalen Pools), gefolgt von einem Elternteil und zwei subgenerationalen Pools. Wenn nur zwei subgenerationalen Pools gemessen werden, würde die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse steigen und viele SNPs würden erhalten werden.
- (1) Wenn das untersuchte Merkmal eine durch EMS induzierte Mutationsmerkmale ist, können nur zwei subgenerationalen Pools (Wildtyp + Mutant) getestet werden, oder ein Elternteil (Wildtyp) und ein subgenerationaler Pool (Mutant) können getestet werden;
- Kann DNA aus Samproben der Eltern sequenziert werden, und kann DNA aus Blättern der Nachkommen sequenziert werden?
- Ob die DNA aus verschiedenen Teilen des Materials die... DNA-Sequenzierung beruht hauptsächlich auf zwei Faktoren: Erstens, die Zusammensetzung des Samenschalens und des Endosperms, das Samenschalen stammt normalerweise von der Mutter, wenn das Samenschalen hauptsächlich betroffen ist; zweitens, der Reinheitsgrad, wenn der Reinheitsgrad hoch ist, unterscheiden sich die Eltern und die Nachkommen nicht sehr, sodass der Effekt nicht signifikant ist.
- Wie man Pools von Nachkommen-DNA mischt?
- Es wird empfohlen, DNA aus jeder Nachkommensprobe separat zu extrahieren und dann gleiche Mengen zu mischen, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren und systematische Fehler zu vermeiden.
- Ist es möglich, die Größe des Kandidatenbereichs und die Anzahl der zu lokalisierenden Kandidatengene zu garantieren?
- Die Größe des Kandidatenbereichs und die Anzahl der Kandidatengene stehen im Zusammenhang mit der Größe der Population, den Unterschieden im elterlichen Material, den Eigenschaften der Zielmerkmale, der Sequierungstiefe, dem genomischen Niveau der analysierten Arten und vielen anderen Faktoren, die durch Verweis auf die Projekterfahrungen oder veröffentlichte Literatur geschätzt werden können.
- Das Lokalisierungsintervall ist groß, wie kann man es anpassen?
- Sie können das Konfidenzintervall anpassen oder SNP- und InDel-Marker im BSA-Lokalisierungsintervall auswählen und eine lokale Kartierung durchführen, um das Lokalisierungsintervall effektiv zu reduzieren.
- Wie man die Zielgene nach dem Screening von Kandidatengen validiert?
- (1) Validierung von SNPs. (A) Konvertierung der Kandidaten-SNPs in CAPS- oder dCAPS-Marker, d.h. Durchführung einer Analyse der Erkennungsstellen von Restriktionsendonukleasen für die Kandidaten-SNPs, Aussortierung der SNPs, die Änderungen in den enzymatischen Erkennungsstellen verursachen, Amplifikation der Fragmente, in denen sich diese SNPs befinden, unter Verwendung der entsprechenden Primer, und anschließend Durchführung der enzymatischen Verdauung und Elektrophorese der amplifizierten Produkte zur Umwandlung der SNPs in CAPS-Marker; Durchführung einer Polymorphismus-Analyse der CAPS-Marker zur Überprüfung der Verwendbarkeit der Marker; (B) Die Kandidaten-SNPs wurden durch PCR amplifiziert, und die Amplifikationsprodukte wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert;
(2) Validierung der Genexpression von Kandidatengen across Phänotypen mittels RT-PCR
(3) Transkriptom-basierte Differenzialexpressionsanalyse um zu sehen, ob es signifikante Unterschiede in der Genexpression gibt
(4) RNAi-Analyse: Verwendung von RNAi-Technologie, um gezielt die Expression spezifischer Gene auszuschalten oder zu deaktivieren.
- (1) Validierung von SNPs. (A) Konvertierung der Kandidaten-SNPs in CAPS- oder dCAPS-Marker, d.h. Durchführung einer Analyse der Erkennungsstellen von Restriktionsendonukleasen für die Kandidaten-SNPs, Aussortierung der SNPs, die Änderungen in den enzymatischen Erkennungsstellen verursachen, Amplifikation der Fragmente, in denen sich diese SNPs befinden, unter Verwendung der entsprechenden Primer, und anschließend Durchführung der enzymatischen Verdauung und Elektrophorese der amplifizierten Produkte zur Umwandlung der SNPs in CAPS-Marker; Durchführung einer Polymorphismus-Analyse der CAPS-Marker zur Überprüfung der Verwendbarkeit der Marker; (B) Die Kandidaten-SNPs wurden durch PCR amplifiziert, und die Amplifikationsprodukte wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert;
- Was könnte der Grund für den unbefriedigenden Positionierungseffekt sein?
- Es gibt viele Faktoren, die zu unbefriedigender Lokalisierung führen, hauptsächlich die folgenden:
(1) große Unterschiede im genetischen Hintergrund zwischen den Eltern, gibt es viele andere Unterschiede zusätzlich zu dem Zielmerkmal, was viel Interferenz in der Analyse erzeugt und es schwierig macht, zu lokalisieren;
(2) Komplexe Merkmalsstatistiken, das Zielmerkmal kann aus mehreren einfachen Merkmalen bestehen, die aufgeteilt und neu lokalisiert werden können, und auch die quantitativen Merkmale selbst sind schwer zu lokalisieren und weisen eine gewisse Unkontrollierbarkeit auf;
(3) Die Sequenzierungsdaten sind kontaminiert, und die Vergleichsergebnisse können überprüft werden, indem ein Teil der Sequenzierungsdaten extrahiert wird, um einen Blast-Vergleich in der nr-Bibliothek durchzuführen;
(4) Die Analysemethode ist nicht anwendbar, wir können stattdessen die ED-Methode und die SNP-Index-Methode zur Lokalisierung verwenden und die Lokalisierungsergebnisse vergleichen.
- Es gibt viele Faktoren, die zu unbefriedigender Lokalisierung führen, hauptsächlich die folgenden:
Probenvorbereitung
- Was sind die Anforderungen an die Eltern, wenn sie das Material entnehmen?
- Die Eltern sollten so rein wie möglich sein, was durch Selbstkreuzung erreicht werden kann. Die beiden Eltern sollten signifikante Unterschiede in den Zielmerkmalen aufweisen, aber andere Merkmale sollten so konsistent wie möglich sein, um die Beeinträchtigung späterer Locus-Analysen zu verringern.
- Was sind die Anforderungen an die Nachkommenpopulation?
- Theoretisch kann die Merkmalssegregation der Nachkommen von Kreuzungen zwischen Eltern mit unterschiedlichen Zielmerkmalen für die BSA verwendet werden, aber die häufiger verwendeten Populationen sind: F2, Rückkreuzungspopulationen, rekombinante selbstinkompatible Linien usw.
Für Qualitätsmerkmale kann das Verhältnis von dominanten zu rezessiven Individuen in der Nachkommenschaft 1:1, 3:1 usw. betragen. Bei quantitativen Merkmalen sollten die Merkmale der Nachkommenschaft einer Normalverteilung entsprechen.
- Theoretisch kann die Merkmalssegregation der Nachkommen von Kreuzungen zwischen Eltern mit unterschiedlichen Zielmerkmalen für die BSA verwendet werden, aber die häufiger verwendeten Populationen sind: F2, Rückkreuzungspopulationen, rekombinante selbstinkompatible Linien usw.
- Ist es möglich, BSA ohne Eltern zu machen?
- Ja, aber es wird nicht empfohlen. Derzeit sind die gängigen Lokalisierungsalgorithmen die ED-Methode und die SNP-Index-Methode, wobei die ED-Methode ohne Eltern durchgeführt werden kann, aber die Wirkung einer solchen Lokalisierung definitiv nicht so gut ist wie das Experiment mit Daten von zwei Eltern. Es wird empfohlen, erneut zu hybridisieren, um die Population zu konstruieren und die elterliche DNA für später aufzubewahren.
- Wie viel Probe ist genug für den Nachwuchs?
- Die Stichprobe der Nachkommen sollte den folgenden Prinzipien entsprechen: Um qualitative Merkmale zu lokalisieren, sollten so viele rezessive Individuen wie möglich ausgewählt werden, mindestens jedoch 20, in der Regel zwischen 30 und 50, und dann die entsprechende Anzahl dominanter Individuen; zur Lokalisierung quantitativer Merkmale werden in der Regel die extremsten 5%-10% der Individuen für jedes Merkmal ausgewählt, und ein Histogramm ähnlich dem folgenden kann auch aus den Merkmalsdaten der Nachkommen erstellt werden:
- Die Nachkommenpopulation ist nicht groß genug. Sollte ich den Extremen oder der Anzahl Vorrang geben?
- Es ist schwierig, mehr als 200 Nachkommenpopulationen für viele Arten zu erstellen, da es weniger als 20 extreme Individuen geben wird. Daher schlagen wir vor, lieber weniger Proben zu nehmen, als Proben mit intermediären Merkmalen auszuwählen, da dies nur die spätere Analyse stören würde. Natürlich besteht ein gewisses Risiko, ob das Experiment mit nur zehn oder mehr Proben pro Pool zufriedenstellende Ergebnisse liefern wird.
- Sollte die Extraktion der Tochter-DNA zuerst gemischt und dann extrahiert werden, oder zuerst extrahiert und dann gemischt werden?
- Der ideale Zustand besteht darin, DNA aus jeder Tochterprobe einzeln zu extrahieren und diese dann gleichmäßig und gleichwertig in eine DNA zu mischen, basierend auf der DNA-Konzentration, sodass die Menge an DNA-Informationen jeder Tochter gleich ist. Aufgrund des derzeit niedrigen Transaktionspreises von Sequenzierungsprojekten ist es jedoch gängige Praxis in den meisten Unternehmen, die Kunden dazu zu bringen, gleich große Mengen Gewebemischung aus jeder Probe zu entnehmen und dann eine gemischte Pool-DNA-Probe zu extrahieren.
Das Mischen und Extrahieren gleichmäßiger Gewebeproben ist nicht so effektiv wie das Mischen nach der Einzelprobenextraktion, aber seine Auswirkungen sind durchaus akzeptabel. Obwohl das Mischen zuerst und dann das Extrahieren zu ungleichen Mengen an DNA aus jeder Probe führen wird, sollten die Genotypen dieser Proben an den Ziel-Loci, wenn die Probenahme ausreichend ideal ist, konsistent sein, und die Hauptauswirkung ist die Zusammensetzung des Hintergrundrauschens, das unsere Fähigkeit, die Ziel-Loci später in der Datenanalyse zu finden, nicht beeinträchtigt.
- Der ideale Zustand besteht darin, DNA aus jeder Tochterprobe einzeln zu extrahieren und diese dann gleichmäßig und gleichwertig in eine DNA zu mischen, basierend auf der DNA-Konzentration, sodass die Menge an DNA-Informationen jeder Tochter gleich ist. Aufgrund des derzeit niedrigen Transaktionspreises von Sequenzierungsprojekten ist es jedoch gängige Praxis in den meisten Unternehmen, die Kunden dazu zu bringen, gleich große Mengen Gewebemischung aus jeder Probe zu entnehmen und dann eine gemischte Pool-DNA-Probe zu extrahieren.
- Was sind die Qualitätsanforderungen an DNA für die Neusequenzierung?
- Obwohl die spezifischen Anforderungen jedes Unternehmens leicht unterschiedlich sind, sind die Qualitätsanforderungen an die DNA für die Neusequenzierung nicht zu hoch. Was Sie selbst tun müssen, ist, das Agarosegel zu laufen, zu beobachten, ob das Hauptband klar und frei von Proteinverunreinigungen ist, und auch die Konzentration und die Gesamtmenge mit einem Spektrophotometer zu überprüfen (es wird empfohlen, dass die Konzentration nicht weniger als 20 ng/ml und die Gesamtmenge nicht weniger als 2 Mikrogramm beträgt).
- Was sind die Tiefenanforderungen für Eltern und Nachkommen bei der Neusequenzierung?
- Um die Genauigkeit von SNP- und InDel-Markern sicherzustellen, sollte das Sequenzieren eine bestimmte Tiefe gewährleisten, wobei für Elternteile empfohlen wird, nicht weniger als 20× zu sequenzieren. Der Mischpool sollte in Kombination mit der Anzahl der Proben so bestimmt werden, dass der Durchschnitt jeder Probe nicht weniger als 1× beträgt. Zum Beispiel, wenn die Nachkommen 30 sind, addiert man 30, dann darf die Sequierungstiefe jedes Nachkommens-Mischpools nicht weniger als 30× betragen. Wenn die Finanzierung es zulässt, kann die Tiefe dann entsprechend erhöht werden.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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