Zusammenfassung der Methoden zur Erkennung von Off-Target-Effekten bei CRISPR-Cas9

Die Gentechnologie steht an der Spitze der aktuellen Lebenswissenschaftsforschung. Für eine erfolgreiche Umsetzung in klinische Anwendungen ist jedoch die genaue Erkennung von Off-Target-Effekten ist unverzichtbar. Die korrekte Bewertung und Minderung von Off-Target-Effekten ist ein dringendes Anliegen. Das Problem der Off-Target-Effekte in der CRISPR-Cas9-Gentechnologie ist seit langem ein Schwerpunkt der Aufmerksamkeit. Es gibt zwei Hauptansätze für Untersuchung der Off-Target-Effekte von CRISPR-Cas9computationalle Simulationsmethoden und Sequenzierungsmethoden ^[1].

Sequenzierungsmethoden zur Erkennung von Off-Target-Effekten bei CRISPR-Cas9

Whole Genome Sequencing (WGS)

Die gesamte Genomsequenzierung (WGS) ist mit minimalen Bewertungsfehlern im Kontext der Bewertung von Cas9-induzierten Off-Target-Mutationen verbunden. Derzeit werden Sequenzierungstiefen von 30-60x typischerweise eingesetzt. Allerdings sind die Kosten für WGS hoch, und bei niedrigeren Sequenzierungstiefen können nur eine geringe Anzahl von Klonen sequenziert werden, wodurch die Mehrheit der niedrigfrequenten Off-Target-Ereignisse möglicherweise übersehen wird. Für die in vivo-Analyse bleibt WGS die bevorzugte Methode, doch Techniken, die direkt Doppelstrangbrüche (DSBs) erfassen, wie BLESS, könnten im Vergleich zu WGS überlegene Fähigkeiten bieten. Dies liegt daran, dass WGS auch natürlich vorkommende Variationen zwischen Zell-/Tiermodellen erfassen kann, was die Analyse komplizieren und zu irreführenden Ergebnissen führen könnte.

In der Analyse von WGS ist die Auswahl geeigneter Kontrollgruppen besonders entscheidend. Um falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse in WGS zu minimieren, erfordert die Analyse oft die Einrichtung mehrerer Gruppen, was sowohl arbeitsintensiv als auch kostspielig sein kann.

Chip-Seq

Cas-Nukleasen, eine Klasse von Proteinen, können einer antikörperbasierten Pull-Down-Methode unterzogen werden, gefolgt von Sequenzierung, einem Verfahren, das als ChIP-Seq bekannt ist. ChIP-Seq wird häufig im Zusammenhang mit der Erkennung von Off-Target-Effekten eingesetzt, die mit dCas9 verbunden sind. Im Gegensatz zu konventionellem Cas9, das die Zielsequenz durchtrennt und zu deren Abspaltung von der DNA-Sequenz und instabiler Bindung führt, behält dCas9, das durch eine Beeinträchtigung der Nukleaseaktivität gekennzeichnet ist, die Fähigkeit, an die Zielsequenz gebunden an gRNA zu binden. Daher wird dCas9 häufig für die CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) verwendet, um die Genexpression zu steigern, anstatt für Gen-Knockouts.

DISCOVER-seq, auch bekannt als MRE11 ChIP-Seq, ist eine kürzlich entwickelte Methode zur Sequenzierung von CRISPR-Cas9-Off-Target-Effekten. Dieser Ansatz nutzt die Rekrutierung des endogenen DNA-Reparaturfaktors MRE11, um Cas-induzierte Doppelstrangbrüche im gesamten Genom zu identifizieren. Während des DNA-Reparaturprozesses wird MRE11 präzise an die Stelle des Auftretens von DSBs rekrutiert. Durch das Pulldown von MRE11-gebundenen Stellen und Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Untersuchung von sowohl On-Target- als auch Off-Target-Ereignissen. Wichtig ist, dass DISCOVER-seq sowohl auf in vivo- als auch auf in vitro-Proben anwendbar ist.

discover-seq

Cas-Nuklease-Spaltung-Stelle und DSB-Stellenanreicherung-Sequenzierung

Die Methode der Sequenzierung, die auf der Anreicherung von Regionen basiert, die von Cas-Nukleasen gebunden oder gespalten werden, wird allgemein als unvoreingenommener Nachweisansatz bezeichnet. Nach diesem Prinzip wurden Anreicherungsmethoden entwickelt, darunter:

(1) Antikörper-Pulldown:

Wie bei Chip-Seq, wo Antikörper verwendet werden, um die Zielregionen zu erfassen.

(2)Anreicherung von Cas-Nuklease-Spaltstellen:

Digenome-Seq, kurz für in vitro Cas9-verdautes Whole-Genome-Sequencing. Nach der Cas9-Spaltung bleibt eine 5'-Phosphatgruppe zurück, die eine Adapterligatur für die PCR-Amplifikation und anschließende NGS-Sequenzierung ermöglicht. Bei Digenome-Seq wird gereinigte genomische DNA (gDNA) in vitro mit Cas9 behandelt, gefolgt von Adapterligatur und umfassendem Whole-Genome-Sequencing. Diese Methode ist für in vitro-Proben geeignet.

(3) Anreicherung von DNA-Doppelstrangbruchregionen (DSB) - DSB-Erfassung:

In BLESS-Seq wird eine direkte Biotin-Affinitätsanreicherung verwendet, um CRISPR-Cas9-gesteuerte DSB-Fragmente zu erfassen, die nach der Adapterligatur sequenziert werden können. Die Biotin-Affinitätsanreicherung erfasst spezifisch DSBs, die aktiv auftreten, und lässt bereits reparierte DSBs unberücksichtigt, was ihr die Bezeichnung "Off-Target-Snapshot" einbringt. Diese Methode wird häufig auf Zell- und Gewebemuster angewendet.

In IDLV-Seq kann der integrationsdefiziente lentivirale Vektor (IDLV) als PCR-Anker verwendet werden, um die durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) erzeugten DSB-Stellen zu amplifizieren. Dies ermöglicht die Erkennung von Off-Target-Stellen. Die Effizienz dieser Methode hängt jedoch von der Fähigkeit des IDLV ab, über NHEJ in DSBs zu integrieren. Darüber hinaus besteht aufgrund der zufälligen Integrationsmerkmale von Lentiviren die Möglichkeit von falsch-positiven Ergebnissen.

HTGST eignet sich zur Erkennung von Chromosomen-Translokationen, die durch CRISPR-Cas9 induziert werden, jedoch ist zu beachten, dass durch CRISPR-Cas9 induzierte Off-Target-Ereignisse hauptsächlich zu Indels führen, die relativ seltener auftreten. Darüber hinaus ist diese Methode weiterhin Einschränkungen durch die Zugänglichkeit der Chromatin unterworfen.

unvoreingenommene Methode

Im Vergleich zu Methoden, die die Schnittstellen von Nukleasen anreichern, sind DSB-Erfassungsmethoden physiologisch relevanter. Sie können jedoch eine geringere Effizienz aufweisen, da die meisten DSBs von sehr kurzer Dauer sind. Das in vivo Tagging von IDLV und die Ligation von in situ Linkern können beide potenziell durch die lokale Chromatin- und Sequenzzusammensetzung in der Nähe der Schnittstelle beeinflusst werden. Folglich können Erfassungsmethoden Verzerrungen unterliegen.

Zusammenfassung der Sequenzierungsmethoden

Zahlreiche Sequenzierungsmethoden sind verfügbar, was es unpraktisch macht, umfassende Beschreibungen jeder einzelnen bereitzustellen. Die unten dargestellte Tabelle bietet die derzeit umfassendste Zusammenstellung. Angesichts der zuvor bereitgestellten Informationen ist es nicht möglich, die überlegene Methode eindeutig zu bestimmen. Die Auswahl der am besten geeigneten Sequenzierungstechnik sollte von den spezifischen Bedürfnissen des Experiments und den finanziellen Mitteln des Forschungsteams geleitet werden.

Computationalle Simulationsmethoden zur Erkennung von Off-Target-Effekten bei CRISPR-Cas9

Diese Techniken dienen dem Zweck, potenzielle Off-Target-Sequenzen vorherzusagen, hauptsächlich aufgrund der Ähnlichkeit zwischen Zielsequenzen und anderen Sequenzen oder der begrenzten Spezifität von Leit-RNAs (gRNAs). Potenzielle Off-Target-Sequenzen können durch die Integration experimenteller Daten oder den Einsatz von Computeralgorithmen abgeleitet werden. Um Off-Target-Effekte zu validieren, greift man häufig auf die Sequenzierung von PCR-Produkten zurück. Diese Ansätze werden oft als "verzerrt" bezeichnet, und die Funktionsweise von Off-Target-Vorhersagetools kann in zwei Hauptmechanismen unterteilt werden: (1) Modelle, die auf Sequenzanpassung basieren, und (2) Vorhersagen, die auf algorithmusbasiertem Scoring beruhen. ^[1].

Mit der zunehmenden Verbreitung der CRISPR-Technologie steigen auch die Erwartungen an ihre Anwendung. Oftmals fehlt es bei der Anwendung von CRISPR-Technologie an der Einbeziehung zusätzlicher Kontrollgruppen in den experimentellen Designs, was in nachfolgenden Experimenten potenzielle Herausforderungen darstellen könnte. Daher ist es ratsam, nach der Anwendung von CRISPR zur Genbearbeitung umgehend eine Off-Target-Analyse durchzuführen oder frühe Proben aufzubewahren. Sowohl Zellen als auch Tiere sind anfällig für spontane Mutationen.

Referenzen:

1. Naeem, Muhammad et al. Neueste entwickelte Strategien zur Minimierung der Off-Target-Effekte bei CRISPR-Cas-vermittelter Genom-Editierung. Zellenvolumen. 2020
2. Ipek Tasan und Huimin Zhao. Zielgerichtete Spezifität des CRISPR/Cas9-Systems.ACS Synthese Biologie 2017 
3. Wienert, B., Wyman, S.K., Yeh, C.D. et al. CRISPR-Off-Target-Erkennung mit DISCOVER-seq. Nat Protoc 15, 1775–1799 (2020)