Richtlinien zur Einreichung von Proben
Nächste Generation Sequenzierung zur Validierung Ihrer CRISPR/Cas9-Bearbeitung
Was ist die CRISPR/Cas9-Technologie?
CRISPR/Cas9-Technologie ist eine der beliebtesten Methoden zur Genom-Editierung, bei der sowohl die Cas9-Endonuklease als auch eine Leit-RNA in die interessierenden Zellen eingeführt werden. Die Leit-RNA ist so konzipiert, dass sie die Cas9-Endonuklease zu einer bestimmten Stelle im Genom lenkt, wo sie einen Doppelstrangbruch (DSB) erzeugt. Es gibt im Allgemeinen zwei Möglichkeiten, den Doppelstrangbruch zu reparieren: nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder homologe gerichtete Reparatur (HDR). NHEJ ist die Hauptform der Reparatur in Säugetierzellen. Da sie fehleranfällig ist, ermöglicht die Reparatur über den NHEJ-Weg Einfügungen, Deletionen und Verlust-of-Function-Mutationen, die wahrscheinlich zu Leserasterverschiebungen führen und die Proteinexpression beeinflussen. Neben Knockout-Mutationen kann eine Template-DNA eingeführt werden, um HDR zu leiten und Mutationen im Zielgen zu erzeugen. HDR kopiert die Template-Sequenz treu an die Schnittstelle des Zielorts.
Abbildung 1. Die Genom-Editierung durch CRISPR/Cas9-Technologie erfolgt über Reparatur.
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Wie man NGS zur Validierung von Genome Editing verwendet
Obwohl das CRISPR-System effizient für die Genom-Editierung ist, werden einige Zellen in einer Population nicht bearbeitet, einige werden ein Allel bearbeitet haben und einige werden beide Allele bearbeitet haben. Es ist wichtig, Genom-Änderungen nach CRISPR/Cas9-Experimenten zu validieren. Next-Generation-Sequenzierung (NGS), als ein leistungsstarker und hochdurchsatzfähiger Ansatz, kann zur Screening von CRISPR-induzierten Mutationen genutzt werden. NGS kann gleichzeitig off-target Veränderungen in einer großen Anzahl von Proben betrachten. Bei der Verwendung dieser Methode ist es notwendig, eine Reihe von Kontrollzellen zu behalten. Software wie CRISPResso kann zur Datenanalyse verwendet werden. NGS ist auch geeignet zur Bewertung von Genomänderungen, die durch ZFN (Zinkfinger-Nuklease) oder TALEN (Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nuklease) erstellt wurden.
Sentmanat u. a. (2018) beschrieb die NGS Ansatz zur Validierung von Genom-Editierungen in seiner veröffentlichten Arbeit. Kurz gesagt, CRISPR-Sequenzierung beinhaltet ein zweistufiges PCR-Protokoll und Deep Sequencing. Zuerst wird die Zielgenomstelle von Interesse mit einem Primer amplifiziert, der partielle Illumina-Sequenzierungsadapter enthält. Anschließend erfolgt eine zweite PCR mit Primern, die Indizes und die erforderlichen Illumina-Sequenzierungsadapter enthalten. Infolgedessen werden die Zielregionen amplifiziert. Die qualifizierten PCR-Produkte werden dann einer Deep-Sequencing-Analyse mit der Illumina MiSeq-Plattform unterzogen.
NGS Techniken zur Validierung umfassen mehrere wichtige Ansätze:
Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) hebt sich als umfassende Methode zur Erkennung von CRISPR/Cas9-induzierten genomischen Veränderungen hervor. Durch die Sequenzierung des gesamten Genoms, WGS bietet unvergleichliche Abdeckung, um Einfügungen, Löschungen und andere Veränderungen zu identifizieren. Diese Technik ist entscheidend für die Bewertung der Effektivität der CRISPR/Cas9-Bearbeitung und deckt gleichzeitig seltene Mutationen im Genom auf.
Die gezielte Amplicon-Sequenzierung hingegen konzentriert sich auf spezifische genomische Regionen, einschließlich CRISPR/Cas9-Zielstellen und angrenzenden Bereichen. Mit ihrer hohen Abdeckungsdichte eignet sich diese Technik hervorragend zur Erkennung minutioser Mutationen und dient als wertvolles Werkzeug zur Bestätigung der Genauigkeit von CRISPR/Cas9-Änderungen. Besonders vorteilhaft für die Bewertung von Änderungen in einzelnen Genen oder einer begrenzten Anzahl von Zielen.
Die Off-Target-Analyse ist entscheidend für die Vorhersage und Sequenzierung potenzieller Off-Target-Stellen, die durch CRISPR/Cas9-Modifikationen entstehen. Diese Methode hilft dabei, die Spezifität und Sicherheit von CRISPR/Cas9-Änderungen zu bewerten, indem unbeabsichtigte Veränderungen identifiziert werden. Sie spielt eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Genauigkeit und Sicherheitsprofile von CRISPR/Cas9-Bearbeitungsmethoden.
Die Langstrecken-PCR und Sequenzierung verfolgen einen komplementären Ansatz, indem sie große genomische Regionen um die CRISPR/Cas9-Zielstellen amplifizieren, bevor sie sequenziert werden. Diese Methode ist besonders geeignet, um strukturelle Variationen und chromosomale Umstellungen, die aus CRISPR/Cas9-Manipulationen resultieren, zu erfassen. Sie erweist sich als wertvolles Werkzeug zur Erkennung erheblicher genomischer Veränderungen, die durch CRISPR/Cas9-Bearbeitungsverfahren induziert werden.
Abbildung 2. CRISPR-Cas9-Aktivität, die mit dem T7E1-Assay und der Next-Generation-Sequenzierung berichtet wurde. (Sentmanat et al., 2018)
Wie werden Off-Target-Mutationen nachgewiesen?
Eine weitere Einschränkung der CRISPR-Technologie ist das Auftreten von Off-Target-Schnitten. Das CRISPR-System schneidet nicht nur an der Zielstelle, sondern auch an unbeabsichtigten Stellen mit ähnlichen Sequenzen. Diese Off-Target-Schnitte können unerwünschte und sogar schädliche Mutationen hervorrufen. In den letzten Jahren haben Wissenschaftler mehrere NGS-basierte Ansätze zur Erkennung von Off-Target-Mutationen.
Tabelle 1. NGS-basierte Ansätze zur Erkennung von Off-Target-Mutationen.
| Analysen | Beschreibung | Ressourcen |
| In vitro genomweite Assays | ||
| Digenome-Seq | Genomisches DNA wird zunächst mit einer Nuklease verdaut und dann einer... Whole-Genome-SequenzierungOff-Targets können rechnerisch identifiziert werden. | Kim u. a.. 2015 Web-Tool: http://www.rgenome.net/digenome-js/#! Code: https://github.com/chizksh/digenome-toolkit2 |
| SITE-Seq | Genomisches DNA wird mit der Cas9-Nuklease geschnitten, und die Schnittstellen der Cas9-Nuklease werden biochemisch markiert und angereichert. Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse wird dann verwendet, um Off-Target-Schnittstellen zu erkennen. | Cameron u. a.. 2017 Protokoll: Protokoll Austausch, doi:10.1038/protex.2017.043 |
| Zellbasierte genomweite Assays | ||
| LAM-HTGTS | Chromosomale Translokationen von Off-Target- und On-Target-Brüchen werden PCR-amplifiziert und analysiert durch NGS. | Kleid u. a.. 2015 Protokoll: Nat Protoc, 11:853-71, 2016 Code:http://robinmeyers.github.io/transloc_pipeline/index.html |
| GLÜCKSELIGKEIT | DSBs sind biochemisch markiert, und ihre nachgelagerten Sequenzen werden PCR-amplifiziert und analysiert mit NGS. | Yan et al. 2017 |
Referenzen:
- Yan W X, Mirzazadeh R, Garnerone S, et al. BLISS ist eine vielseitige und quantitative Methode zur genomweiten Profilierung von DNA-Doppelstrangbrüchen. Naturkommunikationen, 2017, 8: 15058.
- Sentmanat M F, Peters S T, Florian C P, et al. Eine Umfrage zu Validierungsstrategien für CRISPR-Cas9-Bearbeitung. Wissenschaftliche Berichte, 2018, 8(1): 888.
- Frock R L, Hu J, Meyers R M, et al. Genomweite Erkennung von DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch gentechnisch veränderte Nukleasen induziert werden. Naturbiotechnologie, 2015, 33(2): 179.
- Cameron P, Fuller C K, Donohoue P D, et al. Kartierung der genomischen Landschaft der CRISPR–Cas9-Spaltung. Naturmethoden, 2017, 14(6): 600.
- Kim D, Bae S, Park J, et al. Digenome-seq: genomweite Profilierung von CRISPR-Cas9 Off-Target-Effekten in menschlichen Zellen. Nat Methoden, 12:237-43, 2015.
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