Gezielte RNA-Sequenzierung: Aufschlüsselung der Erkennungsprinzipien, Arbeitsabläufe und vielfältigen Anwendungen

RNA-Seqeine Transkriptom-Sequenzierungsanalyse-Technologie, die ermöglicht wird durch Hochdurchsatz-Sequenzierung, zunächst konzentriert auf das Studium der Expressionsniveaus und Unterschiede von mRNA, kleinen RNAs und nicht-kodierenden RNAs. In den letzten zehn Jahren hat es bemerkenswerte Entwicklungen durchgemacht und wird jetzt umfassend in Szenarien wie der Analyse von Transkriptionsvariationen, der Erkennung von Genfusionen und der Identifizierung alternativer Spleißvarianten angewendet. Gezielte RNA-SequenzierungIm Gegensatz dazu konzentriert es sich auf die Analyse spezifischer Transkripte. Ähnlich wie bei der standardmäßigen RNA-Sequenzierung nutzt es gezielte Anreicherungsmethoden zur Bewertung der Genexpression, Analyse von RNA-Spezies, Erkennung von Genfusionen und Mutationen. Es übertrifft jedoch die standardmäßige RNA-Sequenzierung hinsichtlich Sensitivität, dynamischem Bereich, Kosten-Effektivität und Durchsatz.

Was ist gezielte RNA-Sequenzierung?

Die gezielte RNA-Sequenzierung stellt eine Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnik dar. Ihr Ziel ist es, spezifische RNA-Transkripte zu analysieren, um Phänomene wie Genfusionen, Mutationen, Spleißvariationen und phänotyp-spezifische Expressionen zu erkennen. Durch die selektive Amplifikation des cDNA der Zielregion werden die Sequenzierungskosten und -zeiten im Vergleich zur gesamten Transkriptom-RNA-seq reduziert, während die Sensitivität und Spezifität der Experimente erhöht wird. Die wichtigsten Merkmale der gezielten RNA-seq sind wie folgt:

Zielregionen-SelektionZielgerichtete RNA-Sequenzierung amplifiziert selektiv den Ziel-RNA-Bereich durch Fangproben (wie biotinmarkierte Oligonukleotidproben) oder spezifische Primer. Dieser Ansatz ermöglicht die eingehende Analyse spezifischer Gene, Transkripte oder Genfamilien.

Sensitivität und SpezifitätAufgrund seines Fokus auf spezifische Regionen weist gezielte RNA-seq eine höhere Sensitivität bei der Erkennung von niedrig-abundanten Genen, seltenen Fusionsgenen oder spezifischen Spleißvariationen auf. Zum Beispiel kann es bei akuter myeloischer Leukämie (AML) Genfusionen aufdecken, die mit traditionellen Nachweismethoden schwer zu erfassen sind.

GenfusionserkennungDiese Technik wird häufig in der Krebsforschung eingesetzt, insbesondere bei hämatologischen Malignomen, um Genfusionsevents zu erkennen. Zum Beispiel kann sie die Fusion des CRLF2-Gens bei Ph-ähnlicher B-ALL identifizieren.

Mutations- und SpleißvariationsdetektionGezielte RNA-Sequenzierung ist in der Lage, Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen sowie komplexe Spleißvariationen nachzuweisen.

Phänotyp-spezifische ExpressionsanalyseDurch die Analyse der RNA-Expressionsmuster in spezifischen Zelltypen oder Geweben trägt gezielte RNA-Sequenzierung dazu bei, die molekularen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, aufzudecken.

Es ist wichtig zu beachten, dass gezielte RNA-Seq ein leistungsstarkes Werkzeug für hochsensible und spezifische RNA-Analysen in bestimmten Forschungsbereichen ist, jedoch sollte ihre Anwendung auf die spezifischen Forschungsbedürfnisse abgestimmt werden. Die Kombination mit anderen Technologien, wie z.B. der vollständigen Transkriptom-RNA-Seq, kann umfassendere Ergebnisse liefern.

Gezielte RNA-Seq durch Zielerfassung (Hrdlickova et al., 2016)

Das Prinzip der gezielten RNA-Sequenzierung

Gezielte RNA-Sequenzierung ist eine Methode zur Transkriptomanalyse, die auf Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie basiert und darauf abzielt, das Gene oder RNA-Region von Interesse durch spezifisches Design und experimentelle Strategien tiefgehend abzudecken und genau zu analysieren. Ihr grundlegendes Prinzip ist wie folgt.

Auswahl der Zielregion und Entwurf der SondenZuerst ist es notwendig, die RNA-Zielregion zu identifizieren, die sequenziert werden soll. Diese Regionen sind normalerweise Gen-Transkripte, nicht-kodierende RNA usw., die mit spezifischen biologischen Problemen oder Krankheiten in Zusammenhang stehen. Entsprechend der Nukleotidsequenz der Zielregion wird eine spezifische Sonde entworfen, die komplementär zu ihr ist. Sonden sind in der Regel einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, und die Länge variiert normalerweise von Dutzenden bis Hunderten von Basenpaaren. Sie können spezifisch an die Ziel-RNA-Sequenz binden. Um die nachfolgende Handhabung zu erleichtern, kann die Sonde mit speziellen Markierungen wie Biotin versehen werden.

RNA-Extraktion und FragmentierungGesamt-RNA wird aus biologischen Proben (wie Zellen und Geweben) extrahiert, um sicherzustellen, dass die extrahierte RNA eine hohe Integrität und Reinheit aufweist. Anschließend werden physikalische Methoden (wie Ultraschallbehandlung) oder enzymatische Methoden (wie Ribonuklease) verwendet, um RNA in Fragmente geeigneter Größe zu schneiden, die in der Regel etwa 100-500 Basen lang sind, um die nachfolgenden Hybridisierungs- und Sequenzierungsreaktionen zu erleichtern.

HybridisierungsfängungHybridisieren Sie die fragmentierte RNA mit der entworfenen Sonde. Bei geeigneter Temperatur und Salzkonzentration wird die Sonde spezifisch an das Ziel-RNA-Fragment mit komplementärer Sequenz binden, um ein RNA-Sonden-Hybrid zu bilden. Nicht-Ziel-RNA-Fragmente befinden sich weiterhin in einem freien Zustand, ohne an die Sonde zu binden. Um die Effizienz und Spezifität der Hybridisierung zu verbessern, werden dem Hybridisierungssystem häufig einige Reagenzien zugesetzt, die die Hybridisierung fördern, wie zum Beispiel Formamid.

BereicherungRNA-Probe-Hybride werden aus dem gemischten System durch spezielle Labels, die an den Proben angebracht sind, und entsprechende Fangtechniken getrennt. Wenn die Probe beispielsweise mit Biotin markiert ist, können Streptavidin-magnetische Perlen zur Auffangung verwendet werden. Streptavidin hat eine starke Affinität zu Biotin, das spezifisch an das mit Biotin markierte Probe-RNA-Hybrid binden kann. Anschließend werden die magnetischen Perlen und die an sie gebundenen Ziel-RNA-Fragmente durch magnetische Kraft getrennt, um die Ziel-RNA anzureichern und eine große Anzahl von Nicht-Ziel-RNA zu entfernen.

Bibliothekskonstruktion und SequenzierungDie Bibliothekskonstruktion wurde an den erfassten und angereicherten Ziel-RNA-Fragmenten durchgeführt. Im Allgemeinen umfasst dies das Hinzufügen spezifischer Linker-Sequenzen an beiden Enden der RNA-Fragmenten, um sie mit den Primern der Sequenzierungsplattform zu verbinden. Anschließend wurde die Bibliothek durch PCR amplifiziert, um die Menge der Ziel-RNA für die nachfolgende Sequenzierung zu erhöhen. Schließlich wird die konstruierte Bibliothek auf die Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform geladen, um die Sequenzierung durchzuführen, wobei die Sequenzinformationen der RNA durch die Detektion des Signals von jeder Base bestimmt werden, um die detaillierten Sequenzdaten des Ziel-RNA-Bereichs für weitere bioinformatische Analysen, wie z.B. Genexpressionsanalysen und Mutationsdetektionen, zu erhalten.

Zielgerichtete RNA-Seq durch Amplicon-Sequenzierung (Hrdlickova et al., 2016)

Wie funktioniert gezielte RNA-Sequenzierung?

Die gezielte RNA-Sequenzierung umfasst in der Regel die Probenvorbereitung, den Bibliotheksaufbau, die Sequenzierung und die Datenanalyse. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Einführung.

Probenvorbereitung

• Probenentnahme: Wählen Sie geeignete biologische Proben wie Blut, Gewebe und Zellen entsprechend dem Forschungszweck aus. Stellen Sie sicher, dass der Probenentnahmeprozess den Vorgaben entspricht, um die Integrität und biologische Aktivität der RNA zu erhalten.
• RNA-Extraktion: Gesamtes RNA wird aus der Probe mit geeigneten Methoden wie der TRIzol-Methode und der Magnetperlenmethode extrahiert. Nach der Extraktion wird die Integrität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese oder Bioanalysatoren überprüft, und die Konzentration sowie Reinheit der RNA werden mit einem Spektrophotometer bestimmt, um sicherzustellen, dass sie den Anforderungen der nachfolgenden Experimente entspricht.
• RNA-Fragmente: Physikalische Methoden wie Ultraschallbehandlung oder enzymatische Methoden wie RNase werden verwendet, um RNA in Fragmente geeigneter Größe zu schneiden, wobei die Länge der Fragmente in der Regel etwa 100-500 bp beträgt.

Bibliothekskonstruktion

• Sondenhybridisierung: Entwerfen und synthetisieren Sie eine spezifische Sonde für die Ziel-RNA-Region und hybridisieren Sie sie unter spezifischen Bedingungen mit der fragmentierten RNA, sodass die Sonde spezifisch an die komplementäre Sequenz der Ziel-RNA binden kann.
• Erfassung und Anreicherung: Das Ziel-RNA-Fragment, das an die Sonde gebunden ist, wird mithilfe von Biotin und anderen auf der Sonde markierten Labels erfasst, und die ungebundene RNA sowie Verunreinigungen werden durch Waschen und andere Verfahren entfernt, um die Anreicherung der Ziel-RNA zu realisieren.
• Reverse Transkription: Reverse Transkriptase und Primer werden zu der angereicherten Ziel-RNA hinzugefügt, und cDNA wird mit RNA als Vorlage synthetisiert.
• Fügen Sie Linker hinzu: Fügen Sie spezifische Linker-Sequenzen an beiden Enden von cDNA hinzu, um Bindungsstellen für die anschließende PCR-Amplifikation und Sequenzierung bereitzustellen.

PCR-Amplifikation: Das cDNA mit Linker wird durch eine PCR-Reaktion amplifiziert, um die Anzahl der Zielsequenzen für die anschließende Sequenzanalyse zu erhöhen.

Sequenzierung

• Online-Sequenzierung: Die erstellte Bibliothek wird auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform, wie Illumina und PacBio, geladen und gemäß ihren jeweiligen Sequenzierungsprinzipien und -prozessen sequenziert, um eine große Menge an ursprünglichen Sequenzierungsdaten zu generieren.

Datenanalyse

• Datenvorverarbeitung: Qualitätskontrolle der ursprünglichen Sequenzierungsdaten, Entfernung von Sequenzen niedriger Qualität, Verbindungssequenzen usw., um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Daten zu verbessern.
• Vergleich und Annotation: Vergleichen Sie die verarbeiteten Daten mit dem Referenzgenom oder Transkriptom, bestimmen Sie die Position jeder Sequenz im Genom und führen Sie eine Genannotation durch, um die spezifischen Gen- und Transkriptinformationen der Ziel-RNA zu identifizieren.
• Differenzielle Analyse: Entsprechend dem Forschungszweck wurde die differentielle Expression von Genen zwischen verschiedenen Proben analysiert, um die differentiell exprimierten Gene zu identifizieren und weiter die Schlüsselgene und -wege zu untersuchen, die mit Krankheiten oder biologischen Prozessen in Zusammenhang stehen.

Wettbewerbsfähiger Workflow zur Vorbereitung von Ampliconbibliotheken und Übersicht über die Datenanalyse (Blomquist et al., 2013)

Die Vor- und Nachteile von gezieltem RNA-Sequencing

Als wichtige Sequenzierungstechnologie wird gezielte RNA-Sequenzierung häufig in der Biologie und medizinischen Forschung eingesetzt. Im Folgenden sind ihre Vor- und Nachteile aufgeführt.

Vorteile

• Hohe Sensitivität und SpezifitätDie gezielte RNA-Sequenzierung kann eine höhere Sequenztiefe und Sensitivität bieten, indem sie gezielt die Ziel-RNA-Moleküle erfasst, insbesondere zur Detektion von Transkripten mit geringer Häufigkeit. Zum Beispiel kann die gezielte RNA-Sequenzierung bei der Diagnose hämatologischer Malignome klinisch relevante Marker (wie LSC177 oder pLSC632) identifizieren und erworbene somatische Mutationen nachweisen.
• Kosten-EffektivitätDie gezielte RNA-Sequenzierung senkt die Sequenzierungskosten, indem die Sequenzierungsmenge nicht zielgerichteter RNA reduziert wird. Zum Beispiel kann die Vorbereitungsmethode der kompetitiven multiplex PCR-Amplifikationsbibliothek die Konsistenz zwischen verschiedenen Zeitpunkten, der Bibliotheksvorbereitung und den Laboren aufrechterhalten, während die Kosten erheblich gesenkt werden.
• Hintergrundinterferenzen reduzierenDie gezielte RNA-Sequenzierung vermeidet das Problem der unspezifischen Sondenbindung oder der Kreuzhybridisierung von Sonden, wodurch Hintergrundinterferenzen reduziert werden. Darüber hinaus können durch die Optimierung des Designs falsch-positive Signale verringert werden.
• Flexibilität und AnpassungsfähigkeitDie gezielte RNA-Sequenzierungsplattform ist hochgradig anpassungsfähig und kann in die Screening-Pipelines von Qualcomm sowie in die Wirkstoffentwicklung integriert werden, um die Expression von Stressproteinen in spezifischen Signalwegen zu untersuchen.
• Geeignet für komplexe ProbenDie gezielte RNA-Sequenzierung funktioniert gut in komplexen Proben (wie Blut und Tumorgeweben) und kann Fusionstranskripte, Genmutationen und Exon-Sprünge nachweisen.

Nachteile

• Mangel an DesignkomplexitätDie gezielte RNA-Sequenzierung erfordert sorgfältig gestaltete Primer und Sonden, um die spezifische Erfassung der Ziel-RNA sicherzustellen. Dies kann professionelles Wissen und Erfahrung erfordern.
• Begrenzte AbdeckungDie gezielte RNA-Sequenzierung sequenziert normalerweise nur spezifische RNA-Moleküle oder Genregionen, sodass sie nicht die gesamte Transkriptionsgruppe vollständig abdecken kann. Dies kann dazu führen, dass Gene oder Transkripte, die nicht vom Ziel erfasst werden, ausgelassen werden.
• Technische EinschränkungDie gezielte RNA-Sequenzierung kann durch die Abweichung der PCR-Amplifikation beeinträchtigt werden, insbesondere bei der Vorbereitung von Multiplex-PCR-Amplifikationsbibliotheken, da unterschiedliche Ziele aufgrund der Unterschiede in der Amplifikationseffizienz verzerrt sein können. Darüber hinaus werden einige Techniken (wie die Reduzierung von molekularen Barcode-Geräuschen) in der gezielten Sequenzierung selten eingesetzt, da sie nicht-spezifische Störungen einführen können.
• Komplexe DateninterpretationDie Dateninterpretation von gezieltem RNA-Sequencing muss mit biologischem Hintergrundwissen kombiniert werden, um echte Signale von potenzieller technischer Störung zu unterscheiden. Zum Beispiel kann beim Nachweis von Neugeborenen-RNA die RNA-Abbau während der Immunpräzipitation einen Einfluss haben.
• Begrenzter AnwendungsbereichGezielte RNA-Sequenzierung ist besser geeignet, um spezifische biologische Probleme oder Krankheitsmechanismen zu untersuchen als umfassende Genomanalysen. Zum Beispiel kann in der mikrobiellen Analyse die Methode der gesamten Genomsequenzierung besser für die Schätzung der Artenhäufigkeit geeignet sein.

Gezielte RNA-Sequenzierung ist eine effiziente, kostengünstige und empfindliche Technologie, die sich für die Forschung an spezifischen RNA-Molekülen und die Krankheitsdiagnose eignet. Allerdings sind die Komplexität des Designs, die begrenzte Abdeckung und technische Einschränkungen die Hauptprobleme, die überwunden werden müssen.

Schematische Darstellung, wie die wettbewerbsfähige Amplicon-Bibliotheksvorbereitung das Übersampling reduziert (Blomquist et al., 2013)

Anwendungen von gezieltem RNA-Sequencing

Gezielte RNA-Sequenzierung ist eine hochpräzise Transkriptomanalyse-Technologie, die effizient die Gene von Interesse nachweisen und quantifizieren kann, indem sie RNA in spezifischen genomischen Regionen anreichert oder amplifiziert. Diese Technologie wird in vielen Bereichen, einschließlich der Krebsforschung, der Arzneimittelentwicklung, der Neurogenomik und der klinischen Diagnostik, umfassend eingesetzt.

Krebsforschung

Die gezielte RNA-Sequenzierung hat wichtige Anwendungen in der Krebsforschung, insbesondere bei der Erkennung von Tumorgenenfusionen, der Analyse von Genmutationen und Expressionsprofilen.

• Erkennung von Tumorgenenfusionen: Zielgerichtete RNA-Sequenzierung kann bekannte und unbekannte Genfusionen identifizieren, insbesondere in fixierten Gewebeproben (wie FFPE). Diese Methode kann seltene Fusionsgene aufdecken, die durch rezessive Translokation oder Mikrodeletion verursacht werden, und bietet somit neue Ziele für die Krebsbehandlung.
• Analyse der Krebsheterogenität: Zielgerichtete RNA-Sequenzierungstechnologie kann die Heterogenität innerhalb des Tumors aufdecken und helfen, die Komplexität und die Reaktion auf die Behandlung des Tumors zu verstehen.
• Frühe Krebsdiagnose: Zielgerichtete RNA-Sequenzierung verbessert die Sensitivität und Genauigkeit der frühen Krebsdiagnose, indem sie langkettige nicht-kodierende RNA (lncRNA) anreichert.

RNA-Extraktion und Template-Vorbereitung bei Krebs (Hong et al., 2020)

Arzneimittelentwicklung

Gezielte RNA-Sequenzierung spielt eine wichtige Rolle in der Arzneimittelentwicklung. Sie kann spezifische RNA-Regionen genau bestimmen, bei der Suche nach Arzneimittelzielen helfen, die Wirksamkeit von Arzneimitteln durch die Analyse von RNA-Veränderungen vor und nach der Arzneimittelwirkung bewerten und auch die Merkmale von mit Arzneimittelresistenz verbundenen RNAs identifizieren, was eine entscheidende Grundlage für die Optimierung von Arzneimitteln und die Vorhersage von Risiken der Arzneimittelresistenz bietet und den Forschungs- und Entwicklungsprozess sicherer und effektiver Arzneimittel beschleunigt.

• Regulation der Genexpression: Durch gezielte RNA-Sequenzierung können Forscher die Veränderungen der Genexpression von Zellen nach einer Medikamentenbehandlung analysieren und potenzielle Arzneimittelziele identifizieren.
• Konstruktion von Krankheitsmodellen: Mit der RNA-Sequenzierungstechnologie von Qualcomm können wir ein Tumorheterogenitätsmodell aus Patienten erstellen, um die Arzneimittelreaktion vorherzusagen.

Neurogenomik

Gezielte RNA-Sequenzierung wird in der Neurogenomforschung häufig eingesetzt. Sie kann genau auf die Transkription von nervenbezogenen Genen fokussieren, die Unterschiede in der Genexpression und abnormale alternative Spleißvorgänge bei der Nervenentwicklung und neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit aufdecken, indem spezifische RNA-Sequenzen analysiert werden, und sie hilft, die Mechanismen von Nervenkrankheiten zu analysieren und potenzielle therapeutische Ziele zu erkunden.

• Forschung zur neuronalen Entwicklung: Durch die Analyse des Transkriptoms von Nervenzellen können wir das Muster der Genexpression im Prozess der neuronalen Entwicklung aufdecken.
• Studie über den Mechanismus neurologischer Erkrankungen: Zielgerichtete RNA-Sequenzierung kann helfen, abnormale Genexpression im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen zu identifizieren und Hinweise für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten zu liefern.

Überblick über den Ansatz zur Analyse von RNA zur Unterstützung der Diagnose von Dysferlinopathie (Rufibach et al., 2023)

Klinische Diagnose

Die gezielte RNA-Sequenzierung wird häufig in der klinischen Diagnostik eingesetzt, da sie Tumor-assoziierte Gen-Transkripte genau nachweisen und die frühe Screening-, Typisierungs- und Prognosebewertung von Krebs unterstützen kann. Sie kann das Pathogen-RNA identifizieren und die schnelle Diagnose von Infektionskrankheiten unterstützen; sie kann auch verwendet werden, um RNA-Variationen im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen nachzuweisen und eine wichtige Grundlage für die klinische Diagnostik, die Erstellung von Behandlungsplänen und die Krankheitsüberwachung zu bieten.

• Erkennung von Fusionsgenen: Durch gezielte RNA-Sequenzierung können Fusionsgene bei hämatologischen Malignitäten, wie LSC17 oder P63LSC2, nachgewiesen werden, was die klinische Diagnose unterstützt.
• Diagnose seltener Krankheiten: Zielgerichtete RNA-Sequenzierung kann verwendet werden, um die pathogenen Gene seltener Krankheiten zu identifizieren und die Diagnose sowie Behandlung durch die Analyse der Expressionsmuster spezifischer Gene zu unterstützen.

Fallstudie zur gezielten RNA-Sequenzierung bei Genfusionen

Fusionsgene können zu abnormalen Sequenzen oder funktionalen Proteinen führen oder das Ungleichgewicht der Expression bestimmter Gene verursachen, was dann zur Entstehung von Tumoren führen oder diese fördern kann. Es wird berichtet, dass die Inzidenz von menschlichem Krebs, der durch Fusionsgene verursacht wird, etwa 20 % beträgt. Die Häufigkeit von Fusionsgenen variiert jedoch stark zwischen verschiedenen Krebsarten, und viele Fusionsgene sind spezifisch für bestimmte Krebsuntertypen. Daher kann die schnelle und genaue Identifizierung von Fusionsgenen eine qualitative und hierarchische Diagnose von Krebs ermöglichen.

RNA wurde aus den Zelllinien K562 und RDES extrahiert und mit herkömmlichem RNA-seq durch gezieltes RNA-seq verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die ERCC-Häufigkeit des gezielten RNA-seq-Sequenzierens 59-mal (Blutpanel) und 33-mal (solides Tumorpanel) höher war als die des herkömmlichen RNA-seq-Sequenzierens, und die minimale Eingabe für die gezielte Erfassungssequenzierung betrug 3pM. Dies zeigt, dass beide Panels in der gezielten RNA-Sequenzierung eine starke Erfassungsfähigkeit aufweisen.

Die Forscher bewerteten die Zuverlässigkeit des durch zwei Panels nachgewiesenen Fusionsgens. Die Ergebnisse zeigten, dass die Uniformität der Transkriptabdeckung des Panels bei hämatologischen Tumoren und soliden Tumoren gut war, und die Abdeckung der bekannten Spleißstellen betrug 77,8 % bzw. 84,6 %. Dies zeigt, dass beide Panels in der RNA-zielgerichteten Erfassungssequenzierung in der Lage sind, die meisten Fusionsgene nachzuweisen.

Die Studie verglich auch die Detektion von Low-Copy-Fusionsgenen zwischen gezieltem RNA-Sequencing und konventionellem RNA-Sequencing. Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Methoden bei der Detektion von BCR-ABL1 (8-24 DNA-Kopien) in der K562-Zelllinie gab. Als jedoch EWSR1-FLI1 (eine DNA-Kopie) in der RDES-Zelllinie detektiert wurde, wurde beim konventionellen RNA-Sequencing am Anfang der Fusionsstelle keine Abdeckung durch Reads erreicht. Dies zeigt, dass das gezielte RNA-Capture-Sequencing offensichtliche Vorteile gegenüber dem konventionellen RNA-Sequencing bei der Detektion von Fusionsgenen mit niedriger Häufigkeit hat.

Überblick über gezielte RNA-Sequenzierung und Panelvalidierung (Heyer et al., 2019)

Fazit

Die gezielte RNA-Sequenzierung, als leistungsstarkes Mittel zur genauen Untersuchung spezifischer RNA, hat ein einzigartiges Prinzip. Zunächst werden komplementäre Sonden entsprechend der Ziel-RNA-Region entworfen, die spezifisch an die Ziel-RNA binden können, ähnlich wie "präzise Navigation". Die RNA aus der Probe wird extrahiert, fragmentiert und mit der Sonde hybridisiert, und dann wird das Ziel-RNA-Sonden-Hybrid erfasst und durch den Marker angereichert. Anschließend wird die Bibliothek konstruiert und sequenziert, um die Tiefensequenzierung der Ziel-RNA-Region zu realisieren. Ihre Vorteile sind offensichtlich. Im Vergleich zur vollständigen Transkriptom-Sequenzierung kann sie sich stärker auf Schlüsselregionen konzentrieren, mit geringeren Kosten und höherer Sequenzierungstiefe, was eine genaue Erkennung von RNA mit niedriger Häufigkeit erleichtert. Allerdings hat sie auch Einschränkungen, da sie nur für bekannte Zielbereiche geeignet ist und möglicherweise neue Transkripte oder Variationen verpasst.

Im Anwendungsbereich wird gezielte RNA-Sequenzierung häufig eingesetzt. In der wissenschaftlichen Forschung hilft sie, die Funktionen von Genen zu erforschen und deren Rolle in biologischen Prozessen durch die präzise Erfassung der Expression spezifischer Gene zu offenbaren. Im medizinischen Bereich kann sie zur Diagnose von Krankheiten und zur Bewertung der Prognose verwendet werden, beispielsweise durch gezielte Sequenzierung von tumorbezogenen Genen, die eine frühzeitige Diagnose und Überwachung von Tumoren unterstützt. Sie kann auch in der Arzneimittelforschung und -entwicklung eingesetzt werden. Durch die Überwachung der Veränderungen der Ziel-RNA unter dem Einfluss von Medikamenten können die Wirksamkeit und potenzielle Toxizität bewertet werden, was entscheidende Datenunterstützung für die Entwicklung neuer Medikamente bietet.

Referenzen:

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