Ein umfassender Leitfaden zu molekularen HLA-Typisierungstechnologien: Von PCR-basierten Methoden bis hin zu NGS

Im interdisziplinären Forschungsfeld der modernen Medizin und Immunologie ist die iterative Innovation von Humane Leukozyten-Antigen (HLA) Typisierung Die Technologie fördert weiterhin die Entwicklung der Präzisionsmedizin. Als wichtige Brücke zwischen Genpolymorphismus und dem Regulationsmechanismus der Immunantwort spielt die HLA-Typisierung eine zentrale unterstützende Rolle bei der Spender-Empfänger-Zuordnung in der Organtransplantation und der Forschung zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen.

Im Vergleich zur traditionellen serologischen Typisierungsmethode, die auf der antikörperspezifischen Erkennung basiert, hat die molekulare HLA-Typisierungstechnologie einen Paradigmenwechsel von der Analyse des Antigen-Phänotyps zur genauen Genotypidentifikation durch eine eingehende Analyse der Nukleotidsequenz der HLA-Loci vollzogen. Dieser technische Durchbruch hat die Auflösung der HLA-Typisierung erheblich verbessert und einen neuen Forschungsrahmen in den Bereichen Entdeckung seltener Allele, Vorhersage von Transplantatabstoßungen und Prognosebewertung etabliert.

Dieses Papier führt umfassend in die molekulare HLA-Typisierungstechnologie von PCR-basierten Methoden bis hin zu NGS ein, analysiert und vergleicht die gängigen Technologien und die Technologiewahl basierend auf den Anforderungen.

Was ist molekulare HLA-Typisierung?

Molekulare HLA-Typisierung, das heißt HLA-Typisierung auf molekularer Ebene, bezieht sich auf die Methode zur direkten Erkennung der Nukleotidsequenz des HLA-Gens durch molekularbiologische Technologien, um den HLA-Alleltyp von Individuen zu bestimmen. Als Kernkomponente des Hauptgewebekompatibilitätskomplexes (MHC) ist HLA hochgradig polymorph, insbesondere HLA-A, HLA-B und HLA-DRB1, und die Anzahl der Allele hat Tausende erreicht. Der Kern der molekularen HLA-Typisierung besteht darin, die Polymorphie des HLA-Gens auf DNA-Ebene zu analysieren, was eine molekulare Grundlage für die Präzisionsmedizin und die immunbezogene Forschung bietet.

Struktur von HLA-Klasse I- und Klasse II-Molekülen (Deshpande, 2017)

Unterschied zu traditionellen serologischen Methoden

Die traditionelle HLA-Typisierung basiert hauptsächlich auf serologischen Methoden, die HLA-Antigene auf der Zelloberfläche durch Antikörper klassifizieren. Allerdings haben serologische Methoden offensichtliche Einschränkungen.

• Niedrige Auflösung: Serologische Methoden können nur das Antigenspezifitätsniveau identifizieren, können jedoch Allele mit hochähnlichen Aminosäuresequenzen nicht unterscheiden, was es schwierig macht, den Anforderungen an die klinische Hochauflösungs-Typisierung gerecht zu werden.
• Je nach Qualität des Antiserums: Die Herstellung und Lagerung des Antiserums sind streng, und es gibt Unterschiede zwischen den Chargen, die zu ungenauen Typisierungsergebnissen führen können.
• Neue Allele nicht nachweisbar: Für die neuen HLA-Allele, die noch nicht entdeckt wurden, können serologische Methoden sie nicht identifizieren, da es an entsprechenden Antikörpern fehlt.

Im Gegensatz dazu hat die molekulare HLA-Typisierung offensichtliche Vorteile:

• Basierend auf der DNA-Detektion: Die HLA-Gen-Sequenz wird direkt analysiert, was den Einfluss einer abnormalen Expression von Oberflächenantigenen auf die Typisierungsergebnisse vermeidet.
• Hochauflösende Typisierung: Sie kann bis auf die Allelebene genau sein, sogar Allele mit nur einem einzelnen Nukleotidunterschied unterscheiden und eine genauere Grundlage für klinische Anwendungen wie Organtransplantationen bieten.
• Entdeckung neuer Allele: Durch molekularbiologische Techniken, insbesondere NGSNeue HLA-Allele können entdeckt und identifiziert werden, und die HLA-Datenbank wird kontinuierlich angereichert.
• Der hohe Grad an Standardisierung: Der Betriebsablauf und die Datenanalyse der molekularen Typisierungstechnologie können standardisiert werden, wodurch die Beeinflussung durch menschliche Faktoren reduziert und die Wiederholbarkeit sowie Vergleichbarkeit der Ergebnisse verbessert wird.

Allelic Ambiguitäten der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) vs. sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden (SSOP) (Smith et al., 2019)

Vergleich der molekularen HLA-Typisierungstechnologien

In der Entwicklung der HLA-Typisierungstechnologie stellt der Wechsel von der serologischen Methode zur molekularbiologischen Methode einen bedeutenden Fortschritt auf diesem Gebiet dar. Die molekulare Typisierungstechnologie hat ein diversifiziertes technisches System mit unterschiedlichen Ebenen und komplementären Funktionen aufgebaut. Jede technische Methode basiert auf den einzigartigen Prinzipien der Molekularbiologie und zeigt ihre herausragende Leistung in der Anwendung der HLA-Genotypisierung.

PCR-SSP

Basierend auf der PCR-Amplifikation von allelspezifischen Primern entwarf PCR-SSP spezifische Primer, deren 3'-Ende strikt komplementär zur Zielsequenz für HLA-Genpolymorphismus-Stellen ist. Wenn entsprechende Allele in der Template-DNA vorhanden sind, binden sich die Primer genau an das Template und starten die Amplifikation, was zu spezifischen Banden führt, die durch Elektrophorese nachgewiesen werden können. Der technische Kern liegt im Aufbau einer kombinatorischen Bibliothek, die Hunderte von Paaren spezifischer Primer enthält, und der gleichzeitigen Detektion mehrerer Allele durch Multiplex-PCR.

A. Technische Eigenschaften

a) Einfache und schnelle Durchführung: Das Tippen kann innerhalb von Stunden abgeschlossen werden, ohne komplizierte Sondenhybridisierung oder Sequenzierungsschritte.

b) Hohe Auflösung: Sie kann das Niveau der Typisierung mit mittlerer Auflösung erreichen und ist für die meisten klinischen Routineabgleiche geeignet.

c) Die Anforderungen an die experimentellen Bedingungen sind gering: Gewöhnliche PCR-Geräte können dies durchführen, was für grundlegende Labore geeignet ist.

A. Einschränkungen

a) Die Primer-Design ist komplex: Es ist notwendig, spezifische Primer für eine große Anzahl von HLA-Allel zu entwerfen, und die Primerbibliothek ist riesig und die Kosten sind hoch.

b) Unbekannte Allele können nicht nachgewiesen werden: Nur bekannte Allele können nachgewiesen werden, und es gibt nichts zu tun mit neu entdeckten Allelen.

c) Die Auflösung von Heterozygoten ist begrenzt: Bei komplexen Heterozygoten-Proben kann es zu einer Hemmung durch Primerwettbewerb kommen, was zu ungenauen Typisierungsergebnissen führt.

Anzahl der Mehrdeutigkeiten für HLA-A-Typisierung für Exons 1 bis 5 (HDkit/XRkit) (Bouthemy et al., 2018)

PCR-SSO

Die PCR-SSO-Technologie amplifiziert zunächst die Zielregion des HLA-Gens durch PCR und hybridisiert dann das amplifizierte Produkt mit einer sequenzspezifischen Oligonukleotid (SSO)-Sonde, die auf einer Membran oder einem Chip immobilisiert ist. Anhand der Existenz und Intensität des Hybridisierungssignals wird der HLA-Alleltyp bestimmt.

A. Technische Eigenschaften

a) Hohe Auflösung: Eine hochauflösende Typisierung kann insbesondere für die HLA-II-Gen-Typisierung erreicht werden.

b) Hoher Durchsatz: Mehrere Loci und Allele können gleichzeitig durch Chip-Technologie nachgewiesen werden.

c) Die Ergebnisse können quantifiziert werden: Die Intensität des Hybridisierungssignals kann die Häufigkeit der Zielsequenz widerspiegeln, was bei der Analyse von heterozygoten Proben hilft.

B. Einschränkungen

a) Die Arbeitsschritte sind kompliziert: PCR-Amplifikation, Hybridisierung, Membranwäsche und Signaldetektion sind erforderlich, was viel Zeit in Anspruch nimmt.

b) Empfindlich gegenüber experimentellen Bedingungen: Geringe Änderungen der Hybridisierungstemperatur und der Salzkonzentration können die Hybridisierungsergebnisse beeinflussen.

c) Es ist schwierig, die Sondenbibliothek aufrechtzuerhalten: Mit der zunehmenden Anzahl von HLA-Allel muss die Sondenbibliothek ständig aktualisiert werden, und die Kosten sind hoch.

Anzahl der Nullallel-Ambiguitäten für HLA-A, HLA-B und HLA-DRB1-Typisierung (Bouthemy et al., 2018)

Sanger-Sequenzierung

Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die auf der Dideoxy-Kettenabbruchmethode basiert und den Alleltyp bestimmt, indem die Nukleotidsequenz des HLA-Gens gelesen wird. Für die HLA-Typisierung wird normalerweise die Sanger-Sequenzierung nach einer gezielten Amplifikation verwendet, das heißt, das Zielexon des HLA-Gens wird zunächst durch PCR amplifiziert, und dann werden die amplifizierten Produkte in zwei Richtungen sequenziert.

A. Technische Eigenschaften

a) Goldstandardmethode: Die Sanger-Sequenzierung war einst der Goldstandard für HLA-Typisierung, mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit.

b) Direkte Lesesequenz: Die Nukleotidsequenz des HLA-Gens kann direkt ermittelt werden, was die direkteste Evidenz für die Allelidentifikation liefert.

c) Geeignet zur Identifizierung neuer Allele: Neue HLA-Allele können gefunden und identifiziert werden.

B. Einschränkungen

a) Niedriger Durchsatz: Eine Sequenzierung kann nur ein Fragment einer Probe analysieren, was die Anforderungen der Qualcomm quantitativen Typisierung nicht erfüllt.

b) Hohe Kosten: Die Kosten für die Sequenzierungsreaktion und die Reagenzien sind hoch, insbesondere bei der Detektion mehrerer Stellen und Exons.

c) Komplexe Datenanalyse: Bei heterozygoten Unterproben ist es zeitaufwendig und mühsam, die Sequenz manuell zu splicen und zu analysieren.

Zeit und Aufwand für Next-Generation-Sequencing (NGS) und sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden (SSOP) Arbeitsabläufe (Smith et al., 2019)

NGS

NGS-Technologie, auch bekannt als die Technologie der Sequenzierung der neuen Generation, kann gleichzeitig eine große Anzahl von HLA-Genfragmenten durch großangelegte parallele Sequenzierung sequenzieren. Für die HLA-Typisierung wird normalerweise eine gezielte Erfassung oder Multiplex-PCR verwendet, um alle Exons oder vollständigen Sequenzen der HLA-Gene zu amplifizieren, und anschließend wird die Hochdurchsatzsequenzierung verwendet, um die Sequenzierungsreads mit der HLA-Referenzdatenbank zu vergleichen durch Bioinformatikanalyse, um den Alleltyp zu bestimmen.

A. Technische Eigenschaften

a) Qualcomm-Betrag: Eine Sequenzierung kann mehrere HLA-Loci-Typisierungen von mehreren Proben durchführen, was die Nachweis-Effizienz erheblich verbessert.

b) Hohe Auflösung: Die vollständige Sequenzanalyse von HLA-Genen kann durchgeführt werden, wodurch das Niveau der hochauflösenden Typisierung und sogar der Haplotypanalyse erreicht wird.

c) Umfassende Abdeckung: Es kann alle Exons des HLA-Gens erkennen, einschließlich hochpolymorpher Regionen, und vermeiden, wichtige polymorphe Stellen zu übersehen.

d) Entdeckung neuer Allele: Durch unvoreingenommene Sequenzierung können neue HLA-Allele effizient entdeckt und identifiziert werden, und die Aktualisierung der HLA-Datenbank kann gefördert werden.

B. Einschränkungen

a) Hohe Anforderungen an Geräte und Technologie: Professionelle NGS-Ausrüstung und eine bioinformatische Analyseplattform sind erforderlich, und es bestehen hohe Anforderungen an die Laborbedingungen und das Personal.

b) Komplexe Datenanalyse: Massive Sequenzierungsdaten erfordern komplexe bioinformatische Prozesse zur Analyse, einschließlich Sequenzanpassung, Allelzuteilung usw., was hohe Rechenressourcen und Algorithmen erfordert.

c) Höhere Kosten: Obwohl die Kosten für die Einzelsequenzierung mit der Entwicklung der Technologie sinken, sind die Investitionskosten für die Ausrüstung und die Datenanalyse in der frühen Phase weiterhin hoch.

Vergleich gängiger HLA-Typisierungsmethoden (Shahrabi et al., 2019)

Vorteile von NGS bei der molekularen HLA-Typisierung

Im Bereich der hochauflösenden HLA-Typisierung revolutioniert die NGS-Technologie das Erkennungsschema mit ihren einzigartigen Vorteilen. Sie ermöglicht die vollständige Abdeckung der HLA-Gene durch Qualcomm-Parallelsch sequencing, kann komplexe Heterozygoten genau analysieren, die Nachweisrate seltener Allele erheblich steigern, genaue Haplotypdaten für Transplantationsabgleich und Forschungsarbeiten zur Krankheitsassoziation bereitstellen und fördert den Fortschritt der HLA-Typisierung von mittlerer Auflösung hin zur genauen Allelidentifikation.

Gesamte Genabdeckung

Traditionelle HLA-Typisierungstechniken, wie PCR-SSP und PCR-SSO, erfassen normalerweise nur einige hochpolymorphe Regionen der HLA-Gene und können polymorphe Stellen in anderen Regionen übersehen. Die NGS-Technologie kann alle Exons oder vollständige Sequenzen der HLA-Gene durch gezielte Erfassung oder Multiplex-PCR-Amplifikation abdecken. Die Vorteile dieser vollständigen Genabdeckung sind:

• Vermeiden Sie das Auslassen wichtiger polymorpher Stellen: Der Polymorphismus des HLA-Gens existiert nicht nur im klassischen Antigenbindungsbereich, sondern kann auch in anderen Regionen verteilt sein. Der Polymorphismus dieser Regionen kann die Expression und Stabilität von HLA-Molekülen oder die Interaktion mit anderen Molekülen beeinflussen und somit die Immunantwort beeinflussen. Eine vollständige Genabdeckung kann sicherstellen, dass alle polymorphen Stellen, die die HLA-Funktion beeinflussen könnten, erfasst werden.
• Genau Analyse komplexer Allele: Einige HLA-Allele können Mutationskombinationen an mehreren Loci aufweisen, und das bloße Erfassen einiger Regionen kann zu einer falschen Identifizierung von Allelen führen. Eine vollständige Genabdeckung kann umfassende Sequenzinformationen bereitstellen und eine genaue Analyse komplexer Allele gewährleisten.
• Die Haplotype-Analyse wird unterstützt: HLA-Haplotypen können durch die vollständige Gen-Sequenzierung und bioinformatische Analysen abgeleitet werden, was von großer Bedeutung für die Übereinstimmung bei Organtransplantationen und die Forschung zu Krankheitsassoziationen ist.

Verteilung der Anzahl der Reads pro Probe und pro Locus (Liu et al., 2020)

Seltene Allel-Detektion

Die hohe Polymorphie des HLA-Gens führt zur Existenz einer großen Anzahl seltener Allele, die in der allgemeinen Bevölkerung weniger häufig sind, aber in einer bestimmten Population oder Familie häufiger vorkommen können. Traditionelle Typisierungstechniken sind oft schwierig, um seltene Allele zu erkennen, aufgrund der Einschränkungen von Primern oder Sondenbibliotheken, während die NGS-Technologie offensichtliche Vorteile bei der Erkennung seltener Allele bietet:

• Unvoreingenommene Sequenzierung: Die NGS-Technologie kann HLA-Gene in Proben erkennen, ohne die Allelsequenz im Voraus zu kennen, durch Hochdurchsatzsequenzierung, um seltene Allele zu finden und zu identifizieren.
• Hohe Sensitivität: Die NGS-Technologie hat eine hohe Sequenzierungstiefe, kann Allele mit niedriger Frequenz nachweisen und kann das Vorhandensein seltener Allele selbst in heterozygoten Proben genau identifizieren.
• Fördern Sie das Update der HLA-Datenbank: Die Entdeckung und Identifizierung seltener Allele wird dazu beitragen, die HLA-Datenbank zu bereichern und einen umfassenderen Referenzstandard für die HLA-Typisierung weltweit bereitzustellen, insbesondere für die Erforschung seltener Krankheiten und die Transplantationsanpassung von Minderheiten.

Inter-Lot-Vergleich der Prozentsätze der gesamten Reads, die auf jedes Locus abgebildet sind (Liu et al., 2020)

Wie man die richtige Technologie auswählt

Mit der Entwicklung der HLA-Typisierungstechnologie ist es sehr wichtig, die geeignete Sequenzierungsmethode auszuwählen, um genaue und zuverlässige HLA-Typisierungsergebnisse zu erhalten. Verschiedene Forschungsziele, Auflösungsanforderungen, Probenarten, Durchsatz und Kostenüberlegungen werden alle die Auswahl der HLA-Sequenzierungsmethoden beeinflussen.

Abgleich von HLA-Typisierungsmethoden und Probenarten

Die Auswahl der HLA-Sequenzierungsmethoden sollte auf dem Proben-Typ basieren. Der Unterschied in der DNA-Qualität, Integrität und Quelle verschiedener Proben beeinflusst direkt die Anwendbarkeit und Genauigkeit der Sequenzierungstechnologie. Von frischem Blut bis zu FFPE-Proben, von hochqualitativer DNA bis zu mikro-degradierten Proben ist eine präzise Zuordnungstechnologie erforderlich, um die Zuverlässigkeit und Effektivität der HLA-Typisierung zu gewährleisten.

A. Frisches Blut

Frisches Blut ist einer der am häufigsten verwendeten Probentypen bei der HLA-Typisierung, da es reich an weißen Blutkörperchen ist und hochqualitative DNA extrahiert werden kann, die für viele Sequenzierungsmethoden geeignet ist. Für frische Blutproben ist die NGS-Technologie die erste Wahl, wenn hochauflösende Typisierungsergebnisse benötigt werden. Die Qualität der aus frischem Blut extrahierten DNA ist hoch und erfüllt die Anforderungen der NGS-Technologie an DNA-Qualität und -Menge. Durch NGS kann eine hochauflösende Typisierung mit vollständiger Genabdeckung realisiert werden. Wenn die Probenmenge gering oder die Zeit drängend ist, kann auch die Sanger-Sequenzierung für die HLA-Typisierung von frischen Blutproben verwendet werden, insbesondere für die hochauflösende Analyse einer einzelnen Probe.

B. Niedrige DNA-Qualität

Für DNA-Proben von geringer Qualität, wie DNA, die aus Spurenelementen von Blut, getrockneten Blutproben oder anderen Quellen extrahiert wurde, kann die Konzentration und Integrität schlecht sein. In diesem Fall könnte die PCR-SSP-Technologie geeigneter sein, da sie relativ geringe Mengen DNA benötigt, und durch die Optimierung des Primer-Designs und der PCR-Bedingungen kann die Amplifikationseffizienz von DNA geringer Qualität verbessert werden. Wenn NGS-Technologie verwendet werden muss, ist es notwendig, DNA von geringer Qualität vorzubehandeln, wie z.B. durch die Amplifikation des gesamten Genoms, was jedoch Bias einführen kann und bei der Datenanalyse berücksichtigt werden muss.

Genauigkeit der drei Werkzeuge für HLA-Typisierung auf der zweiten oder dritten Feldauflösung bei unterschiedlichen Tiefen und Lese-längen (Liu et al., 2021)

Krankheitskorrelationsforschung

In der Studie über rheumatoide Arthritis (RA) kann die traditionelle PCR-SSP nur die Spezifität des HLA-DR4-Antigens nachweisen, während NGS die Subtypen HLA-DRB1*04:01/04:04 unterscheiden kann. Die Forscher verwendeten NGS, um den gesamten HLA-Gencluster zu sequenzieren, und fanden heraus, dass HLA-DQB103:02 unabhängig mit der Schwere der Erkrankung (OR=1,32, 95% CI 1,17-1,49) in Verbindung stand, abgesehen vom klassischen Shared Epitope. Die Haplotypverknüpfung von HLA-DRB1-DQA1-DQB1 wurde erfolgreich mithilfe der 10X Genomics Long-Read-Sequenzierungstechnologie analysiert, was mit der Short-Read-Technologie nicht erreicht werden konnte.

Positive Vorhersagegenauigkeit der sieben Algorithmen für HLA-Typisierung bei unterschiedlichen Auflösungen und Genen (Liu et al., 2021)

Fazit

Die Entwicklung der molekularen HLA-Typisierungstechnologie hat einen Wandel von traditionellen serologischen Methoden zu molekularbiologischen Techniken durchlaufen. Derzeit umfassen die gängigen molekularen Typisierungstechnologien PCR-SSP, PCR-SSO, Sanger-Sequenzierung und NGS. Jede Technologie hat ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen. In der praktischen Anwendung sollte die geeignete Technologie entsprechend den spezifischen Anforderungen (wie Auflösungsanforderungen, Probenumfang, Zeit und Kosten usw.) ausgewählt werden.

Mit der kontinuierlichen Entwicklung der Technologie und der Senkung der Kosten wird die NGS-Technologie zunehmend in der HLA-Typisierung eingesetzt. Gleichzeitig wird in Kombination mit der Entwicklung der Bioinformatik und der künstlichen Intelligenz die Genauigkeit und Effizienz der HLA-Typisierung weiter verbessert, was eine solidere technische Unterstützung für die Forschung und klinische Anwendung der Präzisionsmedizin und immunologischer Erkrankungen bietet.

Referenzen:

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