Ein Überblick über HLA-Typisierung

Was ist HLA?

Humane Leukozytenantigene (HLAs) sind die menschliche Version des Hauptgewebekompatibilitätskomplexes (MHC). MHC ist eine Gruppe von Zelloberflächenproteinen, die für das erworbene Immunsystem unerlässlich sind, um exogene Moleküle bei Wirbeltieren zu erkennen, was die Gewebekompatibilität bestimmt. HLAs sind auf allen kernhaltigen Zellen im Körper zu finden. Jeder Mensch hat ein einzigartiges Set von HLAs, das zur Hälfte von jedem Elternteil stammt.

Abbildung 1. Genkarte des menschlichen Leukozytenantigen (HLA)-Bereichs (Berlingerio) u. a.. 2009).

HLA besteht aus mehr als 200 Genen auf Chromosom 6 und wird in drei Hauptgruppen unterteilt: HLA Klasse I, HLA Klasse II und HLA Klasse III. HLA Klasse I Gene, einschließlich HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F und HLA-G, produzieren Proteine, die an Peptide auf der Zelloberfläche fast aller Zellen gebunden sind. HLA Klasse I kann fremde Moleküle erkennen und die infizierte Zelle zur Selbstzerstörung anregen. HLA Klasse II Gene, einschließlich HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA und HLA-DOB, stellen Proteine her, die fast ausschließlich auf der Oberfläche bestimmter Immunzellen vorhanden sind. Sowohl MHC Klasse I als auch Klasse II Proteine zeigen Peptide dem Immunsystem. Die von MHC Klasse III Genen produzierten Proteine haben jedoch eine etwas andere Funktion. Sie sind wahrscheinlich an Aktivitäten des Immunsystems wie Entzündungen beteiligt. Einige HLA Gene haben unbekannte Funktionen.

Die klinische Bedeutung von HLA

HLA-Gene weisen viele Variationen auf. Zum Beispiel hat HLA-B27 Hunderte von identifizierten Allelen. Ihr hoher Grad an Polymorphismus ermöglicht es dem Immunsystem des Individuums, auf eine Vielzahl von fremden Eindringlingen zu reagieren, und bestimmte Varianten können mit menschlichen Krankheiten in Verbindung stehen.

• HLA und Krankheit

Mehr als 100 Krankheiten wurden als mit verschiedenen Allelen der HLA-Gene verbunden gemeldet. Viele Krankheiten, wie ankylosierende Spondylitis, Lebererkrankungen, abnorme Immunfunktion und einige Krebsarten, wurden mit spezifischen HLA-Allelen in Verbindung gebracht.

• HLA-System in der klinischen Behandlung

Der Erfolg von Transplantationen oder Transfusionen von Zellen oder Geweben ist stark mit den HLA-Systemen des Spender-Empfänger-Paares verbunden. Wenn die Zelloberflächenmoleküle der Spender von denen des Empfängers abweichen, lösen die Antigene des HLA-Systems starke Immunantworten aus, da sie vom Immunsystem direkt oder indirekt erkannt werden können (Abbildung 2). Der direkte Weg umfasst die direkte Erkennung der HLA-Moleküle, die auf den antigenpräsentierenden Zellen (APCs) des Spenders vorhanden sind, und die Aktivierung immunologisch naiver T-Zellen. Der indirekte Weg beinhaltet die Verarbeitung und Präsentation von spenderabgeleiteten HLA-Peptiden durch die APC des Wirts, was bei Individuen, die Gedächtnis-T-Zellen tragen, effizienter funktioniert.

Abbildung 2. Allorekonition (Brown und Navarrete 2011).

HLA-Typisierung

Da das HLA-System mit der Abstoßung von fremden Zellen und Geweben in Verbindung gebracht wird, HLA-Typisierung wird in klinischen Einrichtungen wichtig, da es ermöglicht, die Immunantwort nach Transplantationen oder Transfusionen vorherzusagen. Darüber hinaus wird die HLA-Typisierung auch als eine Form der klinischen Diagnose verwendet, um Marker für spezifische Krankheiten wie ankylosierende Spondylitis zu identifizieren. Es gibt zwei Hauptmethoden zur HLA-Typisierung, nämlich die Detektion von HLA-Antikörpern und die Detektion von HLA-Polymorphismen.

Abbildung 3. Schematische Darstellung des Nachweisassays für anti-HLA-Antikörper unter Verwendung der Luminex-Technologie und der verschiedenen DNA-basierten Ansätze zur HLA-Typisierung. u. a.. 2016).

• Nachweis von HLA-Antikörpern

HLA-Antikörper wurden bei etwa 20 % der multiparen Frauen und 30-50 % der mehrfach transfundierten Patienten gefunden. Es gibt drei Hauptmethoden zur Nachweis von HLA-Antikörpern, einschließlich der konventionellen serologischen Zytotoxizitätsmethode, der Durchflusszytometrie und der Festphasen-Technik.

• Serologische Zytotoxizitätsmethode

In dieser Methode werden magnetische Perlen verwendet, um B-Lymphozyten für die HLA-Klasse-II-Typisierung aus Blut oder Milz zu isolieren. Die verbleibenden Leukozyten können für die HLA-Klasse-I-Typisierung verwendet werden. Die Lymphozyten werden dann in Terasaki-Platten gegeben, die einzelne Vertiefungen mit verschiedenen spezifischen Antikörpern enthalten. Wenn der spezifische Antikörper und das HLA-Antigen binden, werden die Zellen in dieser Vertiefung absterben. Diese Methode kann HLA- und nicht-HLA-zytotoxische Antikörper nicht unterscheiden.

• Durchflusszytometrie

Hier werden frische nukleierte Leukozyten zu monoklonalen Antikörpern hinzugefügt, die mit einem fluoreszierenden Molekül markiert sind. Zellen mit Oberflächen-HLA-Antigenen, die an den Antikörper binden, fluoreszieren, was durch ein Durchflusszytometer erkannt werden kann, während sie einen Laserstrahl passieren.

• Festphasenverfahren

Fluoreszenzfarbige polystyrolkügelchen, die mit spezifischen HLA-Antigenen beschichtet sind, werden mit dem Serum des Patienten inkubiert, und die Reaktion wird unter Verwendung von PE-konjugierten, spezifischen FC-Antikörpern entwickelt. Diese Methode ist empfindlicher als die serologische Zytotoxizitätsmethode und ELISA, aber der klinische Nutzen der erhöhten Sensitivität ist noch nicht klar definiert.

• Erkennung von HLA-Polymorphismen

Mit der Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) haben DNA-basierte Techniken in Typisierungslaboren aufgrund ihrer Präzision und Reproduzierbarkeit sowie der verbesserten Sensitivität und Auflösung dominiert. Zu den DNA-basierten Techniken gehören PCR-sequenzspezifische Primer (SSP), PCR-sequenzspezifische Oligonukleotide (SSO), Echtzeit-PCR, sequenzierungsbasierte Typisierung (SBT) und die Next-Generation-Sequenzierung (NGS).

NGS, auch bekannt als Hochdurchsatz-Sequenzierung, wird allmählich zur bevorzugten Methode für HLA-Typisierung aufgrund ihrer Genauigkeit, hohen Durchsatz und Schnelligkeit. Der größte Vorteil von NGS besteht darin, Mehrdeutigkeiten zu beseitigen, bei Kosten, die mit SBT vergleichbar sind, und ohne zusätzliche Tests zu erfordern. Der NGS-Prozess umfasst die DNA-Isolation aus Zellen und Amplifikation, die Vorbereitung der DNA-Bibliothek, die gezielte Amplifikation von Genen, die für die HLA-Peptide kodieren, unter Verwendung von Emulsions- oder Festphasen-PCR, die DNA-Sequenzierung-basierte Typisierung und die Sequenzanpassung an Genbank-Datenbanken, wie z.B. die internationale ImMunoGeneTics-Projekt/humanes Leukozytenantigen (IMGT/HLA) Datenbank. Die hochdurchsatzsequenzierungsbasierte HLA-Typisierung wird weitgehend in der klinischen Diagnose, Behandlung und personalisierten Medizin eingesetzt.

Abbildung 4. NGS-Prozess zur HLA-Typisierung.

Tabelle 1. NGS HLA-Typisierungssoftware (angepasst von 4. Hosomichi) u. a.. 2015).

Bei CD Genomics sind wir bestrebt, zuverlässige HLA-Typisierung Dienstleistungen und professionelle bioinformatische Analysen. Darüber hinaus bieten wir auch folgende Dienstleistungen an: CRISPR-Mutations-Sequenzierung, Antikörper-Screening-Sequenzierungund Immunrepertoire-Sequenzierung, um die Arzneimittelentwicklung und klinische Behandlungen zu unterstützen. Bitte zögern Sie nicht, unseren Wissenschaftler für detaillierte Dienstspezifikationen zu kontaktieren.

Referenzen:

1. Berlingerio, Michele, u. a."Abbau klinischer, immunologischer und genetischer Daten von Transplantationen solider Organe." Biomedizinische Daten und Anwendungen. Springer, Berlin, Heidelberg, 2009, 211-236.
2. Brown C J, Navarrete C V. Klinische Relevanz des HLA-Systems bei Bluttransfusionen. Stimme des Blutes, 2011, 101(2): 93-105.
3. Berger. HLA-Typisierung. BMJ2001 Jan 27:322(7280):218.
4. Hosomichi K, Shiina T, Tajima A, u. a.Die Auswirkungen von Next-Generation-Sequenzierungstechnologien auf die HLA-Forschung. Journal für Humangenetik, 2015, 60(11): 665.
5. Ka S, Lee S, Hong J, u. a.HLAscan: Genotypisierung des HLA-Bereichs mithilfe von Next-Generation-Sequencing-Daten. BMC Bioinformatik, 2017, 18(1): 258.
6. Picascia, A., Grimaldi, V., Napoli, C. Von der HLA-Typisierung zur Detektion von Anti-HLA-Antikörpern und darüber hinaus: Der Weg nach vorne. Transplantationsberichte, 2016, 30(4), 187-194. doi:10.1016/j.trre.2016.07.007.