HLA-Typisierung: Einführung, Methoden und Anwendungen

Einführung in die Typisierung von menschlichen Leukozytenantigenen

Die Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) Proteine der Menschen werden durch das HLA (humane Leukozyten-Antigen) System kodiert. Das menschliche Immunsystem wird durch diese Glykoproteine reguliert, die Teil der Zellmembran sind. MHC wird in zwei Klassen unterteilt: MHC Klasse I und MHC Klasse II. Der HLA-Genkomplex befindet sich auf Chromosom 6p21 in einem Bereich von 3,6 Mb. Mit über 10.000 bis heute identifizierten HLA-Allelen sind sie die polymorphste Genfamilie im menschlichen Genom. Infolgedessen kann die Fähigkeit, eine Immunantwort zu bilden, zwischen Individuen innerhalb einer Kohorte, die aus einer einzigen Population stammt, erheblich variieren. Transplantatabstoßung, Autoimmunerkrankungen, Impfstoff-Pharmakogenomik, Krebs, Infektionskrankheiten und Partnerwahl wurden alle mit HLA-Genen in Verbindung gebracht.

HLA-Genotypisierung Der Prozess zur Bestimmung der HLA-Klasse-I- und Klasse-II-Genpolymorphismen eines Individuums ist erforderlich für die Transplantationsanpassung und die Forschung zu Krankheitsassoziationen. Aufgrund der hohen Polymorphie in verschiedenen genomischen Regionen ist eine eindeutige HLA-Genotypisierung technisch herausfordernd. Die Einführung der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat die Landschaft der Genotypisierung verändert. Traditionelle HLA-Genotypisierungs- und Sanger-Sequenzierungsassays haben Einschränkungen, und die hochauflösende HLA-Genotypisierung unter Verwendung von PCR und NGS kann diese Einschränkungen bei Patienten eindeutig erkennen. Sie ermöglicht eine zuverlässige, einfache, qualitativ hochwertige und hochdurchsatzfähige Analyse der wichtigsten HLA-Gene, mit Daten, die auf mindestens sechs Stellen phasiert sind. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Phasierungsproblem gelöst ist, da DNA-Rahmen aus einzelnen Molekülen bestehen.

Nachweis von HLA-Antikörpern und deren Anwendungen

Antikörper gegen HLA wurden bei etwa 20 % der Mehrgebärenden und bei 30 % bis 50 % der mehrfach transfundierten Patienten entdeckt. Die traditionelle serologische Zytotoxizitätsmethode, die Durchflusszytometrie und die Festphasenmethode sind die drei Hauptansätze zur Detektion von HLA-Antikörpern.

Serologische Zytotoxizitätsmethode

Magnetische Perlen werden verwendet, um B-Lymphozyten aus Blut oder Milz für die HLA-Klasse-II-Typisierung zu trennen. Die HLA-Klasse-I-Typisierung kann mit den verbleibenden Leukozyten durchgeführt werden. Die Lymphozyten werden dann in einzelnen Vertiefungen auf Terasaki-Platten platziert, die aus verschiedenen spezifischen Antikörpern bestehen. Die Zellen in dieser Vertiefung sterben ab, wenn der spezifische Antikörper und das HLA-Antigen sich verbinden. Diese Methode kann zwischen HLA- und nicht-HLA-zytotoxischen Antikörpern nicht unterscheiden.

Flusszytometrie

Frisch nucleierte Leukozyten werden in diesem Experiment mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern gemischt. Oberflächen-HLA-Antigene, die an die Antikörper binden, fluoreszieren, wodurch Durchflusszytometer sie erkennen können, während sie durch einen Laserstrahl passieren.

Festphasen-Technik

Die Reaktion wird unter Verwendung von PE-konjugierten, FC-spezifischen Antikörpern etabliert, nachdem mit bestimmten HLA-Antigenen beschichtete, fluorochromgefärbte Polystyrolkügelchen mit dem Serum des Patienten kultiviert werden. Obwohl diese Technik empfindlicher ist als serologische Zytotoxizität und ELISA, muss die therapeutische Wirkung der erhöhten Sensitivität noch bestimmt werden.

Erkennung von HLA-Polymorphismus und dessen Arbeitsablauf

DNA-basierte Methoden haben in Typisierungslaboren seit dem Fortschritt der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dominiert, aufgrund ihrer Präzision und Reproduzierbarkeit sowie der erhöhten Sensitivität und Auflösung. PCR-sequenzspezifische Primer (SSP), PCR-sequenzspezifische Oligonukleotide (SSO), Echtzeit-PCR, sequenzierungsbasierte Typisierung (SBT) und Next-Generation-Sequencing (NGS) sind alles DNA-basierte Methoden.

Aufgrund seiner Genauigkeit, hohen Durchsatzrate und Geschwindigkeit wird NGS, auch bekannt als Hochdurchsatz-Sequenzierung, allmählich zur bevorzugten Methode für HLA-Typisierung. Der bedeutendste Vorteil von NGS besteht darin, dass es Mehrdeutigkeiten beseitigt, und das zu Kosten, die mit SBT vergleichbar sind, ohne dass zusätzliche Screenings erforderlich sind. Die Vorbereitung der DNA-Bibliothek, die gezielte Amplifikation von Genen, die für HLA-Peptide kodieren, unter Verwendung von Emulsions- oder Festphasen-PCR, die DNA-Sequenzierungs-basierte Typisierung und die Sequenzanpassung an Genbankdatenbanken, wie der internationalen ImMunoGeneTics-Projekt/human leukocyte antigen (IMGT/HLA) Datenbank, sind alle Teil des NGS-Prozesses. Die HLA-Typisierung basierend auf Hochdurchsatz-Sequenzierung wird häufig in der klinischen Diagnostik, Behandlung und personalisierten Medizin eingesetzt.

Referenzen:

1. Herzog JL, Lind C, Mackiewicz K, u. a.Bestimmung der Leistungsmerkmale einer NGS-basierten HLA-Typisierungsmethode für klinische Anwendungen. Hallo2016, 87(3).
2. Carapito R, Radosavljevic M, Bahram S. Next-Generation-Sequenzierung des HLA-Locus: Methoden und Auswirkungen auf die HLA-Typisierung, Populationsgenetik und Studien zu Krankheitsassoziationen. Humane Immunologie2016, 77(11).
3. Gabriel C, Fürst D, Faé I, u. a.HLA-Typisierung durch Next-Generation-Sequencing – näher an der Realität. Gewebeantigene2014, 83(2).