Einführung in Amplicon-Sequenzvarianten

In den letzten Jahren, Amplicon-Sequenzierung Die Technologie hat sich als ein entscheidendes Werkzeug für das Studium von Mikrobiomen, Onkologie und Genetik herauskristallisiert. Durch die Durchführung von Hochdurchsatz-Sequenzierungen spezifischer genetischer Regionen können Forscher die Struktur, Funktionen und dynamischen Veränderungen mikrobieller Gemeinschaften aus komplexen Proben entschlüsseln. In der Analyse von Amplicon-Sequenzierungsdaten ist die Tabelle der Amplicon-Sequenzvarianten (ASV) eines der zentralen Datenausgaben, die einen detaillierten Überblick über Sequenzvariationen bietet und als entscheidende Grundlage für nachfolgende Untersuchungen dient. Bioinformatik-Analysen.

Derzeit zeichnen sich gängige analytische Pipelines wie QIIME 2 und DADA2 durch die Erstellung von ASV-Tabellen aus. Es gibt jedoch noch Verbesserungsmöglichkeiten in Bereichen wie Datenverarbeitung, funktionale Annotation und plattformübergreifende Integration. Dieser Artikel untersucht den Aufbau und die Anwendungen von Amplicons und hebt die neuesten Fortschritte sowie zukünftige Entwicklungen in diesem Bereich hervor.

Was sind Amplicon-Sequenzvarianten?

Amplicon-Sequenzvarianten (ASVs) haben sich zu einer weit verbreiteten Hochauflösungstechnik in der Mikrobiomforschung entwickelt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die auf Operational Taxonomic Units (OTUs) basieren, erfassen ASVs Sequenzvariationen auf einer Einzel-Nukleotid-Ebene, was eine verbesserte Präzision und Zuverlässigkeit ermöglicht. Bei der Analyse von 16S rRNA-, 18S rRNA- oder ITS-Amplicon-Daten bieten ASV-Feature-Tabellen detaillierte Einblicke in die mikrobielle Zusammensetzung und Häufigkeit von Proben. Dies macht sie zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Untersuchung der Vielfalt, zur Vorhersage funktioneller Rollen und zur Förderung ökologischer Studien.

Amplicon-Sequenzvarianten vs. OTUs

ASVs und OTUs sind beide Methoden zur Analyse mikrobieller Gemeinschaften basierend auf Sequenzierungsdaten, unterscheiden sich jedoch in ihrem Ansatz. OTUs gruppieren Sequenzen basierend auf einem vordefinierten Ähnlichkeitsschwellenwert, typischerweise 97% Identität, was zu einem Verlust an Auflösung führen kann. Im Gegensatz dazu identifizieren ASVs Sequenzvariationen auf einem Einzel-Nukleotid-Niveau. Die Auswahl von ASV oder OTU Die Analyse von Amplicon-Sequenzierungsdaten hängt von den Forschungszielen, dem experimentellen Design und den Eigenschaften der Proben ab.

Erstellung einer Amplicon-Sequenzvarianten-Tabelle

1. Datenerfassung

Der Aufbau einer ASV-Feature-Tabelle beginnt mit hochwertigen Amplicon-Sequenzierungsdaten. Häufig verwendete Plattformen sind Illumina MiSeq und HiSeq, deren Paarend-Sequenzierungsfähigkeiten hypervariable Regionen wie die V3-V4- oder V4-V5-Regionen des 16S-rRNA-Gens vollständig abdecken können. Die Auswahl der geeigneten Sequenzierungsplattform und Zielregion ist entscheidend für die Gewährleistung der Genauigkeit der nachgelagerten Analysen.

2. Datenvorverarbeitung

Die Datenvorverarbeitung ist grundlegend für den Aufbau der ASV-Feature-Tabelle und umfasst die folgenden Schritte:

• Entfernung von NiedrigqualitätssequenzenVerwenden Sie Qualitätskontrollwerkzeuge (z. B. FastQC), um die Qualität der Rohsequenzen zu bewerten. Die Identifizierung und Eliminierung kompromittierter genetischer Sequenzen ist entscheidend, insbesondere solcher, die durch eine Fülle von mehrdeutigen Nukleotiden, suboptimale Basisqualitätsmetriken oder unzureichende Fragmentlängen gekennzeichnet sind. Das Trimmen und Filtern kann durch robuste Computerwerkzeuge wie Trimmomatic und Cutadapt erfolgen.
• Entfernung von Adapter- und PrimersequenzenAmplicon-Datensätze enthalten häufig Primer- oder Adapterkontaminationen, die potenziell erhebliche analytische Komplikationen verursachen. Computergestützte Ansätze, einschließlich Cutadapt und spezialisierter Datenverarbeitungsbibliotheken, ermöglichen die effektive Entfernung dieser überflüssigen genetischen Elemente.
• Entfernung von Wirts-DNAGenomproben enthalten häufig wirtsabgeleitete DNA von Organismen wie Menschen, Tieren oder Pflanzen, was die Spezifität der Forschung beeinträchtigen kann. Umfassende Dekontaminationsprotokolle beinhalten Ausrichtungstechniken, die systematisch Sequenzen identifizieren und ausschließen, die mit dem Wirtsgenom übereinstimmen, um eine präzise und gezielte genetische Analyse zu gewährleisten.

3. Sequenz-Denoising

Denoising ist der zentrale Schritt des ASV-Ansatzes. Im Gegensatz zur OTU-Klassifizierung unterscheiden Denoising-Algorithmen Sequenzvarianten mit einer Auflösung auf Einzel-Nukleotid-Ebene. Zu den gängigen Werkzeugen gehören:

• DADA2: Verwendet ein probabilistisches Modell, um Sequenzierungsfehler zu korrigieren und fehlerfreie ASVs zu erzeugen. Bevor die DADA2-Verarbeitung durchgeführt wird, stellen Sie sicher, dass die Sequenzierungsdaten die folgenden drei Bedingungen erfüllen: Erstens sollten die Proben in separate .fastq-Dateien aufgeteilt werden; zweitens sollten nicht-biologische Sequenzen, wie Primer und Adapter, entfernt werden. Andernfalls können Trimm-Befehle verwendet werden, um diese Sequenzen von beiden Enden der Reads zu entfernen; und drittens sollten bei der Paar-End-Sequenzierung die Vorwärts- und Rückwärts-.fastq-Dateien übereinstimmende Sequenzen enthalten.
• Deblur: Wendet ein festes Verteilungsmodell für die effiziente Verarbeitung von Kurzlesesequenzen an.

4. ASV-Funktionstabelle Erstellung

Entrauschte Sequenzen werden verwendet, um eine ASV-Feature-Tabelle zu erstellen, die typischerweise als Matrix dargestellt wird, wobei die Zeilen ASVs entsprechen, die Spalten Proben repräsentieren und die Zellwerte die ASV-Häufigkeit in jeder Probe anzeigen. Normalisierung und Filterung von ASVs mit niedriger Häufigkeit können angewendet werden, um Rauschen zu reduzieren.

Tabelle 1. Die generierte ASV-Tabelle

Anwendungen von ASV-Feature-Tabellen

1. Analyse der Diversität mikrobieller Gemeinschaften

ASV-Feature-Tabellen ermöglichen robuste α- und β-Diversitätsanalysen:

• α-DiversitätFokussiert sich auf die Messung der Artenvielfalt und Gleichmäßigkeit innerhalb einzelner Proben. Häufig verwendete Indizes zur Quantifizierung der α-Diversität sind Chao1, der die gesamte Artenvielfalt schätzt, und der Shannon-Index, der sowohl die Häufigkeit als auch die Gleichmäßigkeit der Arten berücksichtigt.
• β VielfaltBewertet die Unterschiede in der Gemeinschaftszusammensetzung zwischen Proben, oft visualisiert durch Techniken wie Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) oder nicht-metrische multidimensionale Skalierung (NMDS).

Funktionale Vorhersage

Durch die Integration von ASV-Feature-Tabellen mit funktionalen Vorhersagetools wie PICRUSt2 können Forscher die funktionalen Fähigkeiten von mikrobiellen Gemeinschaften schätzen. Zum Beispiel nutzte eine Studie, die die Darmmikrobiota untersuchte, PICRUSt2, um Stoffwechselwege vorherzusagen, die mit mikrobiellen Taxa in den ASV-Tabellen verknüpft sind. Diese Analyse hob Assoziationen zwischen spezifischen ASVs und erhöhtem Kohlenhydratstoffwechsel hervor und bot potenzielle Einblicke in Ernährungsstrategien, die die Darmgesundheit verbessern könnten (Wu, Y., et al., 2021).

Abb. 1. Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota in verschiedenen Krankheitszuständen. (Wu, Y., et al., 2021).

3. Entdeckung von Biomarkern für Krankheiten

Die hohe Auflösung von ASVs erleichtert die Identifizierung von krankheitsassoziierten mikrobiellen Biomarkern. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Entdeckung spezifischer ASVs bei Patienten mit kolorektalem Krebs, die im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant angereichert waren. In diesem Fall wurden ASVs, die C. scindens und Blautia sp. zugeordnet sind, als potenzielle Biomarker für die frühzeitige Erkennung von kolorektalem Krebs identifiziert, was zeigt, wie ASV-Feature-Tabellen in der klinischen Diagnostik von Bedeutung sein können (Wu, Y., et al., 2021).

Abb. 2. Leistung bei der Unterscheidung von Adenomen von Kontrollen oder Krebs unter Verwendung wichtiger Merkmale. (Wu, Y., et al., 2021).

4.Umweltökologische Studien

ASV-Feature-Tabellen werden umfassend zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften in Boden, Wasser und Luft eingesetzt. Eine umfassende Analyse von Süßwasserökosystemen ergab, dass ASV-basierte Bewertungen Veränderungen in der mikrobiellen Vielfalt aufgrund von Verschmutzungsgraden erkennen konnten. Forscher fanden heraus, dass bestimmte ASVs Indikatoren für die Wasserqualität waren, was wertvolle Einblicke für die Umweltüberwachung und Naturschutzmaßnahmen bietet (Townsend, A., et al., 2023).

Vorteile des ASV-Ansatzes

• Hohe Auflösung: Der ASV-Ansatz liefert hochauflösende Daten, indem er Sequenzvarianten auf Ebene einzelner Nukleotide unterscheidet. Diese Fähigkeit ist entscheidend für die genaue Identifizierung mikrobieller Arten.
• Reproduzierbarkeit: ASV-Methoden verbessern die Reproduzierbarkeit in mikrobiologischen Studien, indem sie Ergebnisse liefern, die konsistent und unabhängig von subjektiven Clustergrenzen sind.
• Datenbankintegration: Die Fähigkeit, ASVs direkt mit Referenzdatenbanken wie SILVA und Greengenes abzugleichen, verbessert die Klassifikationsgenauigkeit.

Werkzeuge und Ressourcen

1. Amplicon-Sequenzvarianten dada2

DADA2 (Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2) ist ein Open-Source-Softwarepaket, das entwickelt wurde, um Sequierungsfehler von verschiedenen Sequenzierungsplattformen (Illumina, Roche 454) in Amplicon-Daten zu modellieren und zu korrigieren. In Amplicon-Analyse-Workflows leitet der DADA2-Algorithmus präzise Probensequenzen ab und identifiziert Einzel-Nukleotidvariationen, wobei er oft mehr echte Varianten erkennt und weniger fehlerhafte Sequenzen erzeugt als andere Methoden. DADA2 arbeitet, indem es ein Fehlerquotenmodell erstellt, um abzuleiten, ob eine Ampliconsequenz vom Template stammt, und verwendet ein Fehlermodell, das auf den Daten selbst basiert, ohne auf externe Verteilungsmodelle zurückzugreifen. Der entscheidende Vorteil von DADA2 liegt in der Verwendung von mehr Daten, da das Fehlermodell Qualitätsinformationen einbezieht, während andere Methoden diese Informationen nach der Filterung von Sequenzen niedriger Qualität ignorieren. Darüber hinaus berücksichtigt das Fehlermodell von DADA2 die quantitative Häufigkeit und berechnet die Wahrscheinlichkeiten verschiedener Sequenzvarianten.

Andere Werkzeuge

QIIME2 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2) ist eine Open-Source-Software-Suite, die für die Mikrobiomanalyse entwickelt wurde. Sie bietet eine Vielzahl von Werkzeugen und Arbeitsabläufen zur Verarbeitung und Analyse von Mikrobiomdaten.

PICRUSt2: Ein Werkzeug für funktionale Vorhersagen basierend auf ASV-Tabellen.

2. Referenzdatenbanken

SILVA: Unterstützt die taxonomische Annotation von 16S/18S rRNA-Sequenzen.

Greengenes: Bietet Klassifikationsinformationen für Bakterien und Archaeen.

UNITE: Spezialisiert auf die Annotation von Fungal-ITS-Sequenzen.

3. Offene Datenressourcen

Forscher können 16S rRNA-Amplicon-Daten von Plattformen wie NCBI, EMBL-EBI oder MG-RAST abrufen, um ASV-Workflows zu lernen oder zu testen.

Zukünftige Richtungen

• Integration mit Long-Read-Sequenzierung: Die Kombination von ASV-Methoden mit PacBio- oder Nanopore-Sequenzierung wird die Sequenzgenauigkeit erhöhen und ganzheitliche Genomanalysen erleichtern.
• Multi-Omics-Integration: Zusammenführung von ASV-Daten mit Transkriptomik, Metabolomik und anderen Datensätzen, um komplexe ökologische und funktionale Netzwerke aufzudecken.
• Entwicklung effizienter Algorithmen: Erstellung schnellerer Algorithmen zur Unterstützung des großflächigen Aufbaus und der Analyse von ASV-Feature-Tabellen.

Fazit

Als hochauflösende analytische Methode haben ASV-Feature-Tabellen bemerkenswertes Potenzial in der Mikrobiomforschung gezeigt. Ob zur Aufdeckung der Gemeinschaftsvielfalt, zur Vorhersage funktioneller Fähigkeiten oder zur Identifizierung von Krankheitsbiomarkern, ASV-Ansätze bieten einzigartige Perspektiven und Datenunterstützung. Mit den Fortschritten in der Sequenzierungstechnologie und den rechnerischen Werkzeugen werden die Anwendungen und die Forschungstiefe von ASV-Feature-Tabellen weiterhin zunehmen und Innovationen in der Mikrobiologie und medizinischen Forschung vorantreiben.

Referenzen:

1. Wu, Y., Jiao, N., Zhu, R. et al. Identifizierung mikrobieller Marker in verschiedenen Populationen zur frühen Erkennung von kolorektalem Krebs. Nat Commun 12, 3063 (2021). Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von Links nicht direkt übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
2. Townsend, A., den Bakker, H. C. et al. (2023). 16S-Mikrobiom-Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften in Verteilzentren, die frische Produkte bearbeiten. Frontiers in Microbiology, 14, 1041936. Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von URLs nicht abrufen oder übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.