Der Workflow und die Anwendungen der Amplicon-Sequenzierung

Einführung

Die Kombination von Zielanreicherung mit Next-Generation Sequencing (NGS), Amplicon-Sequenzierung, ist ein schneller und effizienter Ansatz, der es Forschern ermöglicht, genetische Variationen in spezifischen Genomregionen zu untersuchen. Diese Methode verwendet spezifische Oligonukleotid-Sonden, um Zielregionen anzureichern, gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung. Dieser hochgradig zielgerichtete Ansatz ermöglicht eine ultra-tiefe Sequenzierung von Ampliconen (PCR-Produkten), was eine genaue und effiziente Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen ermöglicht. 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung wird häufig für phylogenetische und taxonomische Studien verwendet, insbesondere in Metagenomik-Proben. Darüber hinaus können verschiedene Amplicon-Panels für die Krankheitsdiagnose und -prognose eingerichtet werden.

Vorteile

• Ermöglicht Forschern, Varianten gezielt und effizient zu entdecken, zu validieren und zu screenen
• Unterstützt das Multiplexing von Tausenden von Ampliconen pro Reaktion, um eine hohe Sequenzabdeckung zu erreichen
• Ermöglicht gezielte Sequenzierung selbst in komplexen Bereichen, wie GC-reichen Regionen
• Flexible Sondendesigns unterstützen eine Vielzahl von Experimenten
• Reduzierte Sequenzierungskosten und Durchlaufzeiten

Workflow

Abbildung 1. Der Workflow der Amplicon-Sequenzierung.

1. Probenvorbereitung

DNA aus der Probe extrahieren und die DNA quantifizieren.

2. Bibliothekskonstruktion

Der zweistufige PCR-Ansatz wird häufig zur Konstruktion von Amplicon-Sequenzierungsbibliotheken verwendet. In Schritt eins werden speziell entworfene Oligonukleotid-Sonden verwendet, um gezielte genomische Regionen der vorbereiteten genomischen DNA zu amplifizieren und Barcodes (zur Identifizierung von Ampliconen aus verschiedenen Proben) an Ampliconen anzuhängen. Im nächsten Schritt werden Sequenzierungsadapter angefügt. Bibliotheken sollten validiert und gereinigt werden, um zusätzliche Primer und Primer-Dimere zu entfernen.

Abbildung 2. Der Workflow der zweistufigen PCR für die Amplicon-Sequenzierung.

3. Sequenzierung

Illumina HiSeq/MiSeq-Systeme und andere NGS-Plattformen können zur Sequenzierung von Ampliconen verwendet werden. HiSeq kann eine Größenordnung mehr Reads als MiSeq generieren, benötigt jedoch mehr Zeit.

4. Datenanalyse

Die Qualität der sequenzierten Daten muss bewertet werden. Dieser Schritt bestimmt, welche Reads beibehalten, gefiltert, gekürzt oder entfernt werden sollten. Hochwertige saubere Daten werden für die Nachanalyse verwendet.

Tabelle 1. Datenanalyse der Amplicon-Sequenzierung.

Anwendungen

Die Amplicon-Sequenzierung bietet die Flexibilität für Projekte, die auf Studien zur Populationsgenetik, Krebs und genetische Erkrankungen abzielen, sei es expertendefiniert oder kundenspezifisch. Sie ermöglicht auch die Entdeckung somatischer und Keimbahnvarianten.

Die Amplicon-Sequenzierung wurde in folgenden Bereichen angewendet:

Medizinischer Bereich: Entdecken, wie menschliche Mikroben, menschliche Gesundheit/Krankheiten und krankheitsassoziierte Gene miteinander verbunden sind; klinische Diagnose und Prognose; Pharmakogenomik; usw.

Landwirtschaftlicher Bereich: Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und Pflanzen oder Vieh; Gentechnik; markergestützte Züchtung; usw.

Umweltbereich: Umweltüberwachung und -bewertung; Umweltverbesserung; usw.

Referenz:

1. Bybee S M, Bracken-Grissom H, Haynes B D, et al. Zielgerichtete Amplicon-Sequenzierung (TAS): ein skalierbarer Next-Gen-Ansatz für multilokus, multitaxa Phylogenetik. Genome biology and evolution, 2011, 3: 1312-1323.