Wie man mitochondriale DNA isoliert: Ein umfassender Leitfaden

Mitochondrien, die in fast allen Zellen vorkommen, sind Organellen, die ähnlichen wie Miniaturkraftwerke sind und die Energie erzeugen, die benötigt wird, um grundlegende Zellfunktionen aufrechtzuerhalten. Die genetischen Informationen der Mitochondrien sind gespeichert in mitochondriale DNA (mtDNA), das überwiegend in Form von zirkulären Molekülen vorliegt, aber auch lineare Moleküle umfasst. Im Gegensatz zur nukleären DNA ist mtDNA ein nacktes, doppelsträngiges DNA-Molekül, das nicht durch Histone geschützt ist und sich in der Nähe von reaktiven Sauerstoffspezies befindet. Diese Faktoren, zusammen mit der relativ niedrigen Genauigkeit der Replikations- und Reparaturmechanismen der mitochondrialen DNA, führen zu einer höheren Mutationsrate als bei der nukleären DNA. Im Laufe der Zeit hat diese hohe Mutationsrate mtDNA zu einem wichtigen Indikator für das Studium der Auswirkungen von Umweltstress und anderen schädlichen Faktoren gemacht. Die Extraktion mitochondrialer DNA kann uns nicht nur helfen, die Pathogenese mitochondrialer Erkrankungen tiefgehend zu erforschen und wichtige Hinweise für die Entwicklung gezielter Behandlungsmethoden zu liefern, sondern auch eine wichtige Rolle in den Bereichen forensische Medizin, Anthropologie und anderen Bereichen spielen.

Traditionelle Methoden zur Isolierung von mitochondrialer DNA

1) Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation

Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation ist eine klassische und effiziente Methode zur Gewinnung von hochreinem mitochondriale DNA (mtDNA). Diese Technologie basiert auf dem Prinzip der Zentrifugation mit Dichtegradienten aus Cäsiumchlorid und kann DNA-Moleküle unterschiedlicher Dichten effektiv trennen. Im Folgenden sind die detaillierten Schritte nach der Optimierung aufgeführt, die beschreiben, wie man die Cäsiumchlorid-Ultrazentrifuge zur Extraktion von mtDNA verwendet:

Materialien und Reagenzien

Cäsiumchlorid (CsCl)
Ethidiumbromid (EtBr): Wird zur Färbung von DNA verwendet, um eine einfache Beobachtung unter ultraviolettem Licht zu ermöglichen.
Zentrifugenröhre
Ultrazentrifuge
Ultraviolette Lampe
Angemessene Menge Puffer (in der Regel PBS- oder TE-Puffer)
Enzymatische Verdauungsreagenz (optional, zur Verdauung von nicht-mtDNA)

Extraktionsschritte

Zelllyse: Platzieren Sie Zellen oder Gewebeproben in einem geeigneten Lysepuffer. Verwenden Sie mechanische oder chemische Methoden (wie Ultraschall, Gefrier-Tau-Zyklen oder den Einsatz von Lysemitteln), um Zellmembranen zu zerstören und Mitochondrien freizusetzen.
Vorläufige Zentrifugation: Entfernen Sie Zelltrümmer und ungestörte Zellen durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation (ungefähr 1000 g, 10 Minuten).
Der Überstand wurde gesammelt, der Mitochondrien enthielt.
Mitochondrienpräparation: Der Überstand wurde bei hoher Geschwindigkeit (ungefähr 10000 g, 15 Minuten) zentrifugiert, um die Mitochondrien zu sedimentieren.
Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in einer kleinen Menge PBS- oder TE-Puffer.
Hinzufügen von Cäsiumchlorid und Farbstoff: Fügen Sie Cäsiumchlorid und eine kleine Menge Ethidiumbromid (EtBr) zur mitochondrialen Suspension hinzu. Ethidiumbromid bindet an DNA, wodurch die DNA unter ultraviolettem Licht sichtbar wird. Passen Sie die Dichte der Mischung an, um sicherzustellen, dass die DNA korrekt im Dichtegradienten von Cäsiumchlorid geschichtet ist.
Ultrazentrifugation: Übertragen Sie die Mischung in Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie (etwa 100.000 g oder mehr, was normalerweise mehrere Stunden bis über Nacht dauert). Während der Zentrifugation wird die DNA basierend auf ihrer Dichte geschichtet, und mitochondriale DNA (mtDNA) und nukleare DNA werden aufgrund unterschiedlicher Dichten getrennt.
DNA-Extraktion: Verwenden Sie ein ultraviolettes Licht, um das Zentrifugenröhrchen zu inspizieren und das leuchtende DNA-Band zu lokalisieren. Aspirieren Sie vorsichtig die Bänder, die mtDNA enthalten (normalerweise an helleren Stellen, da mtDNA kleiner ist als nukleare DNA). Übertragen Sie die extrahierte mtDNA in einen neuen Behälter.
DNA-Reinigung: Verwenden Sie Alkoholfällung oder andere DNA-Reinigungsmethoden, um Cäsiumchlorid und Ethidiumbromid zu entfernen. Lösen Sie die DNA in TE-Puffer oder einer anderen geeigneten Lösung wieder auf.

2) Säulenchromatographie

Die Extraktion von mitochondrialer DNA (mtDNA) durch Säulenchromatographie ist eine effektive Technik zur Trennung von Biomolekülen, die auf der Wechselwirkung zwischen einer stationären Phase (Säulenmaterial) und einer mobilen Phase (Puffer) basiert, um verschiedene Biomoleküle zu trennen. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Extraktion von mtDNA, da sie die Kontamination von nukleärer DNA reduziert und die Reinheit der mtDNA verbessert. Im Folgenden sind die Schritte zur Extraktion von mtDNA mittels Säulenchromatographie aufgeführt, einschließlich der erforderlichen Materialien und Betriebsdetails.

Materialien und Reagenzien

Lysespülflüssigkeit: Enthält normalerweise nichtionische Tenside, um Zellmembranen zu zerstören.
Säulenchromatographie-Säule: Häufig verwendet werden Silikagelmatrix oder Ionenaustauscherharz.
Elutionspülflüssigkeit: pH und Salzkonzentration werden angepasst, um die Elution von DNA zu optimieren.
Zentrifugenröhre: Wird zur Sammlung elutierter Proben verwendet.
Zentrifuge: Wird für die Probenentnahme und Elutionsschritte verwendet.
Mikrozentrifugenröhrchen: Wird verwendet, um die endgültige DNA-Lösung zu sammeln.
Ethanol oder Isopropanol: Verwendet zur DNA-Fällung.
TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0): Wird verwendet, um gereinigte DNA aufzulösen.

Extraktionsschritte

Zelllyse: Mischen Sie Zielzellen oder Gewebe mit Lysepuffer. Lysieren Sie die Zellen vollständig und setzen Sie Mitochondrien frei, indem Sie leichte Schüttelbewegungen, Gefrier-Tau-Zyklen oder Ultraschall verwenden.
Mitochondriale Isolation: Entfernen Sie Zelltrümmer und große, ungestörte Zellen durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation (z. B. 1.000 × g, 10 Minuten).
Der Überstand wird gesammelt und die Mitochondrien werden dann durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation (z. B. 10.000 × g, 15 Minuten) ausgefällt. Der Überstand wurde verworfen und die ausgefällten Mitochondrien wurden in einer kleinen Menge Lysepuffer resuspendiert.
DNA-Extraktion: Fügen Sie die geeignete Menge an Nukleinsäure-Extraktionspuffer und Protease K zur mitochondrialen Suspension hinzu, um das Protein zu verdauen und DNA freizusetzen. Die DNA wurde mit der Phenol-Chloroform-Methode extrahiert und anschließend mit Ethanol oder Isopropanol gefällt.
Säulenchromatographie-Reinigung: Resuspendieren Sie die ausgefällige DNA in einem geeigneten Puffer und laden Sie sie in eine zuvor vorbereitete Säulenchromatographiesäule. Eluieren Sie nicht spezifisch adsorbierte Substanzen mit Elutionspuffer. Erhöhen Sie schrittweise die Salzkonzentration im Elutionspuffer, um mtDNA spezifisch zu eluieren. Sammeln Sie das Eluat, das hochreine mtDNA enthält.
DNA-Präzipitation und Resuspension: Fügen Sie 2,5 Volumina 100% Ethanol und 1/10 Volumina 3M Natriumacetat zur Eluat hinzu, mischen Sie und lagern Sie es über Nacht bei -20 °C, um DNA zu präzipitieren. Nach der gefrorenen Präzipitation wird das DNA-Präzipitat durch Zentrifugation gesammelt (z. B. 12.000 × g, 30 Minuten, 4 °C). Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das DNA-Präzipitat mindestens einmal mit 70% Ethanol und zentrifugieren Sie erneut, um die DNA zu gewinnen. Lassen Sie das DNA-Präzipitat an der Luft trocknen oder trocknen Sie es kurz im Vakuum, um ein vollständiges Trocknen zu vermeiden, was die Resuspension der DNA erschwert. Die getrocknete DNA wurde in einer kleinen Menge TE-Puffer resuspendiert, vollständig gelöst und bei -20 °C gelagert.

3)DNase-Methode

Die DNase-Extraktion von nukleärer DNA (ntDNA) ist eine effektive Technik, die nukleäre DNA reinigt, indem DNase I, ein Enzym, das spezifisch DNA spaltet, verwendet wird, um mitochondriale DNA (mtDNA) oder andere nicht-zielgerichtete DNA in einer Probe zu verdauen und zu entfernen. Diese Methode ist besonders geeignet für Experimente, die hochreine nukleäre DNA erfordern, wie z. B. genomische Forschung auf Chromosomenebene oder forensische Anwendungen. Die folgenden sind die detaillierten Schritte zur Extraktion von nukleärer DNA mit der DNase-Methode:

Materialien und Reagenzien

DNase I: Ein Enzym, das spezifisch Einzel- und Doppelstränge von DNA spaltet.
Puffer: DNase I-Reaktionspuffer wird normalerweise verwendet, und die spezifischen Komponenten werden gemäß den Anweisungen des Enzyms vorbereitet.
Lysespuffer: Wird zur Zelllyse und Freisetzung von DNA verwendet.
Proteinase K: Wird zur Proteolyse eingesetzt, um die Freisetzung von DNA zu gewährleisten.
Phenol-Chloroform-Lösung: Wird zur DNA-Extraktion und -Reinigung verwendet.
Ethanol oder Isopropanol: Verwendet zur DNA-Fällung.
TE-Puffer: Verwendet zur Resuspension von DNA.
Zentrifugenröhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen: verwendet für die Probenverarbeitung und -sammlung.
Zentrifuge: Wird für verschiedene Zentrifugationsschritte verwendet.
Temperaturgeregeltes Wasserbad oder Heizblock: Wird verwendet, um die Temperatur des Enzymbehandlungsschrittes zu steuern.

Extraktionsschritte

Zelllyse: Platzieren Sie eine Zell- oder Gewebesprobe in einem Zentrifugenröhrchen, das mit Lysepuffer gefüllt ist. Proteinase K, normalerweise in einer Konzentration von 100 μg/mL, wird dem Zentrifugenröhrchen hinzugefügt, um Proteine zu verdauen und DNA freizusetzen. Die Proben wurden bei 56 °C für mehrere Stunden oder über Nacht inkubiert, um die Zellen vollständig zu lysieren.
DNase I Verarbeitung: Bereiten Sie die DNase I Lösung vor: Stellen Sie den DNase I Reaktionspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers her und fügen Sie DNase I hinzu (in der Regel 1-10 Einheiten/μg DNA). Fügen Sie die DNase I Lösung zur lysierten Probe hinzu und mischen Sie gut. Inkubieren Sie bei 37°C für eine angemessene Zeit (in der Regel 30 Minuten bis 1 Stunde), um der DNase I zu ermöglichen, die mtDNA vollständig zu spalten. Die Aktivität der DNase I kann durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM oder durch andere in den Anweisungen empfohlene Methoden beendet werden.
DNA-Extraktion: Fügen Sie eine gleiche Menge Phenol-Chloroform-Lösung zu der bearbeiteten Probe hinzu, schütteln Sie sie gründlich und zentrifugieren Sie sie anschließend, um die Schichten zu trennen. Übertragen Sie die DNA-haltige wässrige Phasensupernatante vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie den Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt bei Bedarf, um den Reinigungseffekt zu erhöhen.
DNA-Fällung: Fügen Sie 0,1 Volumen 3M Natriumacetat und 2,5 Volumen 100% Isopropanol zur Überstand hinzu. Nach dem Mischen bei -20 °C über Nacht kühlen, um die DNA-Fällung zu fördern. Am nächsten Tag wird das DNA-Präzipitat durch Zentrifugation gesammelt (z.B. 12.000 × g, 30 Minuten, 4 °C), der Überstand wird verworfen und das Präzipitat wird mit 70% Ethanol gewaschen. Lufttrocknen oder sanft erhitzen, bis das DNA-Präzipitat gerade trocken ist, um übermäßiges Trocknen zu vermeiden, und dann die DNA mit einer angemessenen Menge TE-Puffer resuspendieren.

4) Alkalische Lyseverfahren

Die Alkali-Denaturierungsmethode ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Extraktion von mitochondrialer DNA (mtDNA), die besonders für kleine Experimente und vorläufige Forschungen geeignet ist. Diese Methode basiert auf den Dissoziationseigenschaften von DNA unter alkalischen Bedingungen. mtDNA kann durch eine einfache alkalische Behandlung effektiv freigesetzt und gereinigt werden, insbesondere wenn sie aus Zellkulturen oder einer kleinen Anzahl von Gewebeproben extrahiert wird. Im Folgenden sind die detaillierten Schritte zur Extraktion von mtDNA mit der Alkali-Denaturierungsmethode aufgeführt:

Materialien und Reagenzien

NaOH (Natriumhydroxid): Die übliche Konzentration beträgt 50 mM.
EDTA: Endkonzentration von 1 mM, verwendet zur Chelatbildung von Metallionen und zur Verhinderung von DNase-Aktivität.
Tris-HCl: Wird verwendet, um DNA-Lösungen zu neutralisieren, pH 8,0, normalerweise in einer Konzentration von 1M.
Eiskaltes Ethanol: Wird zur DNA-Fällung verwendet.
TE-Puffer: Zur Resuspension von DNA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
Mikrozentrifugenröhrchen.
Zentrifuge.
Vortexmischer.
Wasserbad oder Heizblock: Wird verwendet, um Proben zu erhitzen.

Extraktionsschritte

Probenvorbereitung: Sammeln Sie Zell- oder Gewebeproben in Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie die entsprechende Menge PBS-Puffer hinzu und entfernen Sie überschüssigen Puffer und Verunreinigungen durch Zentrifugation (3000 × g, 5 Minuten).
Alkalische Behandlung: Fügen Sie eine Mischung aus 50 mM NaOH und 1 mM EDTA zur Probe hinzu, mit einem Volumen von etwa 100-200 μL, abhängig von der Probengröße. Nach kurzem Vortex-Mischen wurde die Probe in einem Wasserbad bei 95 °C für 10-30 Minuten erhitzt, um eine vollständige Freisetzung der DNA zu ermöglichen.
Neutralisationsreaktion: Entfernen Sie die Probe aus dem Heizblock und fügen Sie sofort ein gleiches Volumen von 1M Tris-HCl, pH 8,0 hinzu, um sie zu neutralisieren.
Nach dem Mischen kurz schwenken und schnell auf Raumtemperatur abkühlen.
DNA-Präzipitation: Fügen Sie 2-2,5 Volumina eisgekühlten Ethanols zur neutralisierten Probe hinzu und mischen Sie gut.
Frieren Sie die Mischung bei -20 °C für mindestens 2 Stunden oder über Nacht ein, um die DNA-Ausfällung zu maximieren.
DNA sammeln: Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 12000 × g bei 4 °C, um das DNA-Prezipitat zu sammeln. Der Überstand wurde verworfen, das DNA-Prezipitat wurde mit 70% eisgekühltem Ethanol gewaschen, und der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt. Verwerfen Sie erneut den Überstand und lassen Sie das DNA-Prezipitat an der Luft trocknen, um übermäßiges Austrocknen zu vermeiden.
DNA resuspendieren: Den getrockneten DNA-Pellet in der entsprechenden Menge TE-Puffer resuspendieren. Die DNA vollständig auflösen, indem man sie vorsichtig schwenkt oder für mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen lässt.

Aufkommende Technologie zur Isolierung von mitochondrialer DNA

Magnetische Partikeltrennmethode

Die Methode der magnetischen Bead-Trennung ist eine innovative Technologie zur Trennung von mitochondrialer DNA. Ihr einzigartiger Mechanismus basiert auf der Wechselwirkung von spezifischen Liganden, die auf der Oberfläche von magnetischen Beads modifiziert sind, mit Mitochondrien oder mitochondrialer DNA. Magnetische Beads bestehen normalerweise aus magnetischen Materialien (wie Magnetit oder magnetischem Eisenoxid) mit einer funktionellen Oberfläche, die mit Liganden modifiziert ist, die spezifisch an Mitochondrien oder mitochondriale DNA binden können. Diese Liganden können Antikörper, Nukleinsäure-Aptamere usw. sein. Am Beispiel von mit Antikörpern modifizierten magnetischen Beads können Antikörper spezifisch an bestimmte Proteine auf der Oberfläche von Mitochondrien binden. Wenn magnetische Beads zu dem Zelllysat hinzugefügt werden, erkennen und binden die Antikörper auf der Oberfläche der magnetischen Beads an das Zielprotein auf der Oberfläche der Mitochondrien und bilden einen magnetischen Bead-Mitochondrien-Komplex. Unter dem Einfluss eines externen Magnetfeldes bewegt sich der magnetische Bead-Mitochondrien-Komplex in Richtung des Magnetpols und wird von anderen Verunreinigungen getrennt. Auf diese Weise können Mitochondrien schnell und effizient von Zelllysaten getrennt werden. Wenn mitochondriale DNA direkt isoliert werden soll, können magnetische Beads verwendet werden, die mit Nukleinsäure-Aptameren modifiziert sind, die spezifisch an mitochondriale DNA binden können. Aptamere können an spezifische Sequenzen der mitochondrialen DNA binden und so eine selektive Auffangung der mitochondrialen DNA erreichen.

Kit-basierte Trennmethode

Häufig verwendete Kits zur Isolierung von mitochondrialer DNA auf dem Markt haben ihre eigenen Arbeitsprinzipien und Betriebsverfahren. Kits, die auf dem Prinzip der Silikagelmembranadsorption basieren, sind weit verbreitet. Am Beispiel eines bestimmten Marken-Kits zur Isolierung von mitochondrialer DNA ist der Ablauf wie folgt: Zunächst werden Zellproben gesammelt und zentrifugiert, um das Kulturmedium zu entfernen. Dann wird eine angemessene Menge Zelllysepuffer hinzugefügt, der spezielle Inhaltsstoffe enthält, die Zellmembranen zerstören und Cytoplasma sowie Mitochondrien freisetzen können. Zelltrümmer und große Partikel werden dann durch einen Zentrifugationsschritt entfernt, und der Zelllysat wird in eine Zentrifugensäule mit einer Silikagelmembran übertragen. Unter Hochsalzbedingungen wird mitochondriale DNA spezifisch an der Silikagelmembran adsorbiert, während andere Verunreinigungen mit dem Elutionsmittel herausfließen. Die Silikagelmembran wird dann mit Waschpuffer gewaschen, um verbleibende Verunreinigungen zu entfernen. Schließlich wird die an der Silikagelmembran adsorbierte mitochondriale DNA mit einem Niedrigsalz-Elutionspuffer eluiert. Dieses auf Silikagelmembranadsorption basierende Kit ist relativ einfach zu bedienen, kann effektiv nukleare DNA und andere Verunreinigungen entfernen und ist für die Verarbeitung großer Probenmengen geeignet.

Abbildung 1. Totale zelluläre DNA wird zu Kontrollzwecken isoliert. (Quispe-Tintaya, W., et al., 2013)

Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von mitochondrialer DNA (mtDNA), einschließlich Ultrazentrifugation, Säulenchromatographie, DNase-Behandlung und alkalischer Denaturierung, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Die Ultrazentrifugation bietet hohe Reinheit, erfordert jedoch einen komplexen Betrieb, die Säulenchromatographie reduziert die Kontamination mit nukleärer DNA, die DNase-Methode verbessert die Reinheit der nukleären DNA, und die Methode der alkalischen Denaturierung ist einfach, kann jedoch die Integrität beeinträchtigen. Als aufkommende Technologie bietet die Methode der magnetischen Bead-Trennung Vorteile in Bezug auf Geschwindigkeit und Effizienz. Die Wahl der richtigen Methode ist entscheidend für die Genauigkeit der Studie.

Referenz:

1. Quispe-Tintaya, W., White, R. R., Popov, V. N., Vijg, J., & Maslov, A. Y. (2013). Schnelle Isolation von mitochondrialer DNA aus Säugetierzellen für die Next-Generation-Sequenzierung. BioTechniques, 55(3), 133–136. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text an, den Sie übersetzt haben möchten.