Analyse menschlicher mitochondrialer Genome durch Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten

Menschliches mitochondrialen Genom

Mitochondrien, essentielle Organellen, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen, sind zentral für die Energieproduktion durch aerobe Atmung und spielen eine Schlüsselrolle in zellulären Prozessen. Sie besitzen ihr eigenes einzigartiges genetisches Material, das mitochondriale Genom (mtDNA).

Menschliche mtDNA ist ein zirkuläres Molekül, das 16.569 Basenpaare umfasst und aus schweren und leichten Strängen besteht. Es ist überwiegend ein kodierender Bereich und umfasst 37 Gene, darunter 22 tRNAs, 2 rRNAs und 13 Proteine, die für die Komponenten der mitochondrialen Elektronentransportkette entscheidend sind. Im Gegensatz zur nukleären DNA folgt mtDNA einem strikten matrilinearen Erbgang.

Innerhalb der Zellen sind Mitochondrien zahlreich, wobei jedes mehrere mtDNA-Kopien enthält. Diese Multikopiennatur führt zu genetischer Vielfalt, wobei die Mutationsraten von 0 % bis 100 % reichen. Veränderungen in der Mutationslast während der Zellteilung können die Energieproduktion beeinflussen, was zu einem "Schwellenwert-Effekt" und zellulärer Dysfunktion führen kann.

Die Keimbahnselektion prägt die Diversität der menschlichen mitochondrialen DNA. (Wei et al., 2019)

Hochdurchsatz-Sequenzierung von mitochondrialen Genomen

In sowohl klinischen als auch wissenschaftlichen Studien gibt es eine wachsende Vorliebe für den Einsatz fortschrittlicher Techniken wie Next-Generation Sequencing (NGS), einschließlich gezielter Panel-Sequenzierung, Sequenzierung des gesamten mitochondrialen Genoms, Whole Exome Sequencing (WES) und Whole Genome Sequencing (WGS), für die umfassende Analyse mitochondrialer Genome. Durch die Anwendung dieser Methoden wird nicht nur die analytische Effizienz erheblich gesteigert, sondern auch die Sensitivität bei der Erkennung pathogener Varianten deutlich verbessert, hauptsächlich aufgrund der Vergrößerung der Stichprobengrößen.

Präzise Next-Generation-Sequenzierung zur Erkennung von Tumormitochondrien-DNA-Mutationen. (Guo et al., 2020)

• Gezielte Panel-Sequenzierung

In den Anfangsstadien der Next-Generation-Sequencing (NGS) für mitochondriale Erkrankungen werden nur spezifische Segmente des mitochondrialen Genoms sequenziert. Diese Segmente umfassen Peptide, die die Atmungskette kodieren, sowie bekannte Gene, die mit Erkrankungen assoziiert sind. Alternativ können wir alle mitochondrialen Gene auswählen, einschließlich sowohl mitochondrialer DNA (mtDNA) als auch nuklearer DNA (nDNA), wie sie in MitoCarta aufgeführt sind. Dieses umfassende Panel wird häufig als "MitoExome" bezeichnet.

• Whole Mitochondriale Genomsequenzierung

Die Nutzung von NGS für die Sequenzierung des gesamten mitochondrialen Genoms ermöglicht es uns, alle Varianten der mitochondrialen DNA (mtDNA) zu erkennen und bietet eine präzise Bewertung der Variantenheterogenität. Bevor wir mit der gesamten Exomsequenzierung (WES) beginnen oder Whole Genome Sequenzierung (WGS)Viele mitochondriale Diagnosetzentren führen häufig mtDNA-Sequenzierungen durch. Dies dient dem doppelten Zweck, potenziell pathogene mtDNA-Varianten zu identifizieren und deren Vorhandensein auszuschließen. Es ist erwähnenswert, dass viele pathogene mtDNA-Varianten ausschließlich in klinisch betroffenen Geweben, wie zum Beispiel Skelettmuskulatur, zu finden sind.

• Whole Exome Sequencing: Gesamtes Exom-Sequenzieren

Im Wesentlichen, Whole Exome Sequencing (WES) beinhaltet das gezielte Sequenzieren von exonen Regionen innerhalb des Genoms. Ein erheblicher Teil der WES-Daten wird jedoch aus nicht gezielten Regionen generiert, einschließlich des mitochondrialen Genoms. Da das mitochondriale Genom aus Tausenden von Kopien besteht, im Gegensatz zum diploiden nukleären Genom, gibt es signifikant mehr Off-Target mtDNA-Sequenzen als Off-Target nDNA-Sequenzen (im Faktor von 30-120 Mal). Bemerkenswerterweise ist der Anteil der erfassten mtDNA-Sequenzen mit der Häufigkeit von mtDNA in der ursprünglichen Gesamt-DNA-Probe korreliert. Zum Beispiel enthalten einzelne Zellen im Herzen und Skelettmuskel einen höheren mtDNA-Gehalt als peripheres Blut. Die hohe Kopienzahl von mtDNA führt zu einer Mischung aus Wildtyp- und mutierter mtDNA in Proportionen, die als Heterogenität bekannt sind und theoretisch kontinuierlich von 0 % bis 100 % reichen können. Darüber hinaus sind pathogene mtDNA-Mutationen typischerweise hoch heterozygot oder homozygot bei Trägern, zeigen jedoch eine niedrige Heterozygotie in Fällen von asymptomatischen pathogenen mtDNA-Mutationen. Umgekehrt ist bekannt, dass die mtDNA-Kopienzahl hoch variabel ist und mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, assoziiert ist. Daher ist die mtDNA-Kopienzahl eine entscheidende Kennzahl für die Analyse des mitochondrialen Genoms. Da die Abdeckung der Sequenzierungsdaten direkt proportional zur Anzahl der Chromosomen ist, ist es möglich, die mtDNA-Kopienzahl aus WES-Daten zu schätzen.

• Whole Genome Sequenzierung

WGS bietet die Möglichkeit, alle genetischen Varianten im gesamten menschlichen Genom zu erkennen, was das diagnostische Potenzial für mitochondriale Erkrankungen erheblich verbessert. Einige Studien haben eine hohe Übereinstimmung zwischen traditionellen PCR-basierten Methoden und WGS Daten zur Analyse von mtDNA-Varianten. Darüber hinaus sind Schätzungen der mtDNA-Kopienzahl, die aus WGS-Daten abgeleitet werden, tendenziell zuverlässiger.

Bioinformatische Analyse von mitochondrialen Genomen

• Erkennung von mitochondrialen Varianten

Derzeit fehlt es an Konsistenz in der Software und den Prozessen, die zur Identifizierung mitochondrialer Varianten in verschiedenen Forschungsartikeln verwendet werden. Es wurden mehrere Software-Tools entwickelt, um mitochondriale Varianten aus Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten zu analysieren und zu detektieren, wie z.B. mtDNA-Server, MitoSeek, MToolBox und andere. Für umfassende Anleitungen zur Analyse mitochondrialer Genome ist es ratsam, sich auf die empfohlenen Verfahren von GATK zu beziehen, die hier detailliert beschrieben sind.

Darüber hinaus, wenn man mitochondriale Gene analysiert, indem man Whole Exome Sequenzierung (WES) oder Whole Genome Sequencing (WGS) Die Qualitätskontrolle von Varianten ähnelt eng dem Prozess des nukleären Genoms. Es ist wichtig, beim Berechnen der Sequenzierungstiefe auf die Referenzversion des Genoms zu achten. Beachten Sie, dass im menschlichen hg19-Referenzgenom das mitochondriale Genom als CRS (NC_001807) dargestellt wird, während das derzeit gängige menschliche mitochondriale Referenzgenom rCRS (NC_012920) ist.

• Zuweisung von Mitochondrialen Haplogruppen

Derzeit ist die am häufigsten verwendete Software zur Zuordnung von mitochondrialen Haplogruppen zu Proben HaploGrep2. HaploGrep2 weist den mitochondrialen Haplogruppen jeder Probe basierend auf PhyloTree17 zu, wobei rCRS als Referenzgenom dient. Diese Software ermöglicht auch die direkte Eingabe einer Variantendatei (vcf-Datei), um die am besten geeignete mitochondriale Haplogruppe für jede Probe zu bestimmen, basierend auf den in jeder Probe nachgewiesenen mitochondrialen Varianten. Eine weitere praktikable Option zur Zuordnung von Haplogruppen ist MitoTool.

• Schätzung der mitochondrialen Kopienzahl

Während der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) haben sowohl autosomale als auch mitochondriale Chromosomen die gleiche Wahrscheinlichkeit, nachgewiesen zu werden. Folglich ist die durchschnittliche Abdeckung von autosomalen und mitochondrialen Chromosomen theoretisch proportional zu ihrer Kopienzahl.

Mitochondriale Varianten-Datenbanken

Im Gegensatz zur nukleären DNA (nDNA) ist die Verfügbarkeit von Populationsdatenbanken für Varianten der mitochondrialen DNA (mtDNA) erheblich eingeschränkt. Glücklicherweise wird die Praxis, mtDNA-Sequenzen aus bestehenden Whole Exome Sequencing (WES) Analysen erneut zu analysieren, zunehmend angewendet und Whole Genome Sequencing (WGS) Datensätze werden weitgehend akzeptiert und genutzt. Mehrere umfangreiche mitochondrialen Datenbanken auf Bevölkerungsebene sind entstanden, darunter Mitomap, HmtDB, 1000 Genomes, gnomAD und MitImpact.

Mitomap ist die herausragende Wahl für die mtDNA-Analyse. Neben der Funktion als Repository für mtDNA-Varianten über verschiedene Populationen hat es sich zu einer entscheidenden Ressource für die mitochondrialen Forschungscommunity entwickelt. Mit jahrzehntelanger Anerkennung aktualisiert Mitomap sein Datenset, indem es mtDNA-Sequenzen halbjährlich aus GenBank extrahiert und einer rigorosen bioinformatischen Analyse unterzieht. Stand 1. Juli 2022 umfasst Mitomap 56.910 vollständige mtDNA-Sequenzen und 78.504 mtDNA-Kontrollregion-Sequenzen, einschließlich 19.449 mtDNA-Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs).

Die gnomAD (Genome Aggregation Database), die größte Open-Source-Datenbank für menschliche Variationen, machte mtDNA-Varianten im November 2020 erstmals mit gnomAD v3.1 öffentlich zugänglich. Diese umfasst insgesamt 56.434 mtDNA-Sequenzen aus WGS-Daten und enthält 10.850 mtDNA-Varianten.

Im Gegensatz dazu basiert die HelixMTdb-Datenbank auf WES-Daten von 196.554 nicht verwandten Individuen und erfasst insgesamt 15.035 mitochondriale Varianten. Bemerkenswerterweise stammt ein großer Teil dieser Proben aus europäischen Populationen.

HmtDB ist eine weitere bemerkenswerte Datenbank, die Proben mit sowohl gesunden als auch krankheitsbezogenen Phänotypen umfasst. Sie ist sorgfältig gestaltet, um die Populationsgenetik zu unterstützen und Klinikern bei der Bewertung der Pathogenität spezifischer mtDNA-Varianten zu helfen. Es ist erwähnenswert, dass sowohl HmtDB als auch Mitomap ihre mtDNA-Sequenzen aus GenBank beziehen, was zu einer erheblichen Überschneidung der Probenquellen zwischen diesen beiden Datenbanken führt.

Zusätzlich bieten einige der weit verbreiteten Krankheitsdatenbanken für nukleare DNA-Varianten, einschließlich ClinVar, Clinvar Miner und OMIM, ganz zu schweigen von Mitomap und HmtDB, auch Informationen zu den klinischen Auswirkungen von mtDNA-Varianten. Stand 1. Juli 2022 hat Mitomap Daten zu 455 rRNA/tRNA-Mutationen und 545 kodierenden/nicht kodierenden Varianten, die mit Krankheiten assoziiert sind, zusammengestellt, von denen nur 97 Varianten eindeutig als pathogen kategorisiert wurden.

Werkzeuge zur Vorhersage der Auswirkungen mitochondrialer Varianten

Zahlreiche Werkzeuge, die zur Bewertung der Schädlichkeit von Varianten in den kodierenden Regionen der nukleären DNA (nDNA) entwickelt wurden, können auch auf Varianten in den kodierenden Regionen der mitochondrialen DNA (mtDNA) angewendet werden. Zu den bekanntesten dieser Werkzeuge gehören CADD, PolyPhen-2, SIFT, Mutpred und PROVEAN, von denen mehrere umfassend zur Priorisierung von nDNA-Varianten genutzt werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass einige dieser Werkzeuge, die ursprünglich für nDNA-kodierende Regionen entwickelt wurden, bei der Anwendung auf mtDNA-kodierende Regionen eine reduzierte Genauigkeit aufweisen können.

Referenzen:

1. Wei, Wei u. a. "Die Selektion der Keimbahn formt die Vielfalt der menschlichen mitochondrialen DNA." Wissenschaft 364.6442 (2019): eaau6520.
2. Guo, Shanshan, et al. "Eine innovative Datenanalysemethode zur genauen Erkennung von Mutationen der mitochondrialen DNA von Tumoren durch Next-Generation-Sequencing." Molekulare Therapie-Nukleinsäuren 23 (2021): 232-243.